Time-restricted feeding ameliorates non-alcoholic fatty liver disease through modulating hepatic nicotinamide metabolism via gut microbiota remodeling
包含体内小鼠模型（HFD/TRF/PF）、体外HepG2细胞实验、FMT实验以及代谢组学和宏基因组学等多层级验证。
C57BL/6J小鼠高脂饮食诱导NAFLD模型 HepG2细胞FFA诱导脂质沉积模型 高脂饮食小鼠粪便移植模型
16:8限时进食方案，进食窗口8小时，禁食16小时，持续6周 N-Me-6-PY和N-Me-4-PY剂量（生理浓度2.5倍、5倍、10倍）及体内注射剂量（150 µg/kg和75 µg/kg） AOX1抑制剂肼苯哒嗪（hydralazine）给药剂量50 mg/kg，口服灌胃 FMT实验中抗生素鸡尾酒（新霉素、链霉素、杆菌肽）预处理1周，粪菌悬液200 µL/只，每周3次，持续4周 HFD配方（60%脂肪，TROPHIC，TP23400）
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估TRF对HFD诱导的NAFLD小鼠肝脏脂肪变性的改善作用，并区分其与食物摄入减少的独立效应。
5-6周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为四组：普通饮食（CD）、高脂饮食（HFD）、限时进食（TRF，HFD 6周后给予16:8限时进食6周）、配对喂食（PF，HFD 6周后食物量与TRF组相同但不限制时间窗口），共12周。检测体重、食物摄入、肝脏组织学（H&E、油红O染色）、NAS评分、血浆和肝脏脂质水平、肝功能指标及氧化应激指标。
鉴定TRF改善NAFLD可能涉及的差异代谢物及相关代谢通路。
采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）对小鼠血浆进行非靶向代谢组学分析，通过OPLS-DA、火山图、MSEA等分析差异代谢物，并与TRF/ PF比较。
定量验证TRF对肝脏和血浆烟酰胺代谢通路中关键代谢物水平的影响。
采用靶向LC-MS/MS分别测定血浆和肝脏样本中NAM、NA、NAD+、1-MNA、N-Me-6-PY、N-Me-4-PY的水平，并计算N-Me-6-PY/1-MNA和N-Me-4-PY/1-MNA比值以反映AOX1酶活性。
验证N-Me-6-PY和N-Me-4-PY对肝细胞脂肪合成和脂质沉积的直接影响。
在HepG2细胞中，用不同浓度（生理浓度的2.5倍、5倍、10倍）N-Me-6-PY和N-Me-4-PY预处理1小时，然后与0.6 mM FFA（OA:PA=2:1）共孵育24小时，检测油红O染色、细胞内TG/TC含量，以及脂肪生成相关基因（SREBP-1c、ACC1、FASN）和脂肪酸摄取相关基因（CD36、FATP2、FABP4）的mRNA和蛋白表达。
验证N-Me-6-PY和N-Me-4-PY在体内是否加重肝脂肪变性，以及药理学抑制AOX1能否改善NAFLD。
给CD或HFD小鼠腹腔注射N-Me-PYs混合物（N-Me-6-PY 150 µg/kg，N-Me-4-PY 75 µg/kg）或溶剂，持续6周；另一组HFD小鼠口服AOX1抑制剂肼苯哒嗪（50 mg/kg）。检测肝脏组织学、脂质水平、体重等指标。
分析TRF对NAFLD小鼠肠道菌群组成和多样性的影响，并寻找与烟酰胺代谢相关的关键菌群。
对小鼠盲肠内容物进行宏基因组测序，分析α多样性、β多样性及不同分类水平上的菌群相对丰度差异，并通过Metastats分析鉴定TRF特异性调节的菌种，并与NAFLD相关指标及NAM代谢参数进行相关性分析。
验证TRF调节的肠道菌群是否能转移TRF对NAM代谢和肝脏脂肪变性的有益效应。
以HFD喂养9周的受体小鼠，先用抗生素鸡尾酒（新霉素、链霉素、杆菌肽各1 mg/mL）处理1周以清除肠道菌群，然后口服来自HFD或TRF供体小鼠的粪菌悬液（100 mg粪便/1 mL PBS，200 µL/只，每周3次，持续4周）。检测体重、肝脏组织学、脂质、肝功能以及血浆N-Me-6-PY/4-PY水平和肝脏AOX1、NNMT蛋白表达。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 高脂饲料 | TROPHIC | TP23400 |
| FMT实验 | 新霉素 | MCE | HY-B0470 |
| 链霉素 | MCE | HY-B1906 | |
| 杆菌肽 | APExBIO | B1670 | |
| 磷酸盐缓冲液 | -- | -- | |
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Gibco | C11995500BT |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099148 | |
| 细胞处理 | 油酸 | Sigma-Aldrich | 75090 |
| 棕榈酸 | Solarbio | P9830 | |
| N-甲基-6-吡啶酮-3-甲酰胺 | MCE | HY-113432 | |
| N-甲基-4-吡啶酮-5-甲酰胺 | MCE | HY-113472 | |
| 体内实验 | 肼苯哒嗪 | Sigma-Aldrich | H1753 |
| 生化检测 | 甘油三酯检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A110-1-1 |
| 总胆固醇检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A111-1-1 | |
| 低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A113-1-1 | |
| ALT检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C009-2-1 | |
| AST检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C010-2-1 | |
| GSH检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A006-2-1 | |
| MDA检测试剂盒 | Solarbio | BC0025 | |
| 细胞实验 | CCK8检测试剂盒 | Beyotime | C0037 |
| 油红O溶液 | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Fdbio science | FD009 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | CWBIO | CW2200S | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | CWBIO | CW2383S | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Fdbio science | FD2001 | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| ECL化学发光试剂 | Millipore | WBKLS0500 | |
| NNMT抗体 | Proteintech | 15123-1-AP | |
| AOX1抗体 | Proteintech | 19495-1-AP | |
| FASN抗体 | Proteintech | 10624-2-AP | |
| ACC1抗体 | Proteintech | 67373-1-Ig | |
| FABP4抗体 | Proteintech | 12802-1-AP | |
| FATP2抗体 | Proteintech | 14048-1-AP | |
| β-actin抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| CD36抗体 | Immunoway | YT5585 | |
| SREBP-1c抗体 | Immunoway | YT6055 | |
| 二抗 | Proteintech | SA00001-1 | |
| 二抗 | Asbio | AS006 | |
| qRT-PCR | AG RNAex Pro总RNA提取试剂 | Accurate Biotechnology | AG21102 |
| Evo M-MLV逆转录试剂盒 | Accurate Biotechnology | AG11728 | |
| SYBR Green qPCR预混液 | Accurate Biotechnology | AG11702 | |
| 引物 | GENEray Biotechnology | -- | |
| 宏基因组测序 | 磁珠法土壤和粪便DNA提取试剂盒 | TIANGEN BIOTECH | DP712 |
| Qubit® dsDNA检测试剂盒 | Life Technologies | -- | |
| Qubit® 2.0荧光计 | Life Technologies | -- | |
| NEBNext® Ultra™ DNA文库制备试剂盒 | NEB | -- | |
| AMPure XP磁珠纯化系统 | Beckman Coulter | -- | |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| cBot簇生成系统 | Illumina | -- | |
| Illumina NovaSeq测序平台 | Illumina | -- | |
| 代谢组学 | 超高效液相色谱仪 | SCIEX | -- |
| QTRAP®质谱系统 | SCIEX | -- | |
| Agilent 1290 Infinity II超高效液相色谱 | Agilent Technologies | -- | |
| 6470B三重四极杆液质联用系统 | Agilent Technologies | -- | |
| Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18色谱柱 | Waters | -- | |
| Thermo Hypersil Gold C18色谱柱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| LightCycler 480实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| 图像分析 | ImageJ软件 | National Institutes of Health | -- |
| 数据统计分析 | GraphPad Prism 9.0 | GraphPad Software | -- |
| R软件 | R Foundation | -- | |
| MetaboAnalyst 5.0 | MetaboAnalyst | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 小鼠品系、性别、年龄、饲养环境（SPF、光照周期、温度、湿度）、HFD配方（60%脂肪，TROPHIC，TP23400）、饮食干预周期（12周） 阅读提示：Materials and methods: Animal experiment and diet design |
| TRF干预 | TRF具体方案（16:8限时进食，进食窗口8小时，禁食16小时）、TRF起始时间（HFD喂养6周后）、干预时长（6周） 阅读提示：Materials and methods: Animal experiment and diet design; Figure 1(a) |
| 配对喂食（PF） | PF组食物量匹配TRF组但不限制时间窗口的具体操作 阅读提示：Materials and methods: Animal experiment and diet design |
| 肠道菌群清除与粪菌移植 | 抗生素鸡尾酒（新霉素、链霉素、杆菌肽）浓度、给药方式（饮水）、持续时间（1周）、粪菌悬液制备（100 mg粪便/mL PBS）、移植体积（200 µL/只）、频率（每周3次）和持续时间（4周） 阅读提示：Materials and methods: Fecal microbiota transplantation (FMT) |
| 体外细胞模型 | HepG2细胞培养条件（DMEM、10% FBS、37°C、5% CO2）、N-Me-6-PY和N-Me-4-PY的浓度梯度（2.5倍、5倍、10倍生理浓度）、FFA处理（总浓度0.6 mM，OA:PA=2:1）及处理时间（1小时预处理，24小时刺激） 阅读提示：Materials and methods: Cell culture; Result section: N-Me-6-PY and N-Me-4-PY promote... |
| 体内给药 | N-Me-PYs混合物剂量（N-Me-6-PY 150 µg/kg + N-Me-4-PY 75 µg/kg）和给药方式（腹腔注射）；肼苯哒嗪剂量（50 mg/kg）和给药方式（口服灌胃）；干预周期（6周） 阅读提示：Materials and methods: N-Me-PYs in vivo assay |
| 代谢组学分析 | 血浆样本体积、提取溶剂比例、UPLC-MS/MS参数（色谱柱、流动相、梯度、流速、柱温）、质谱参数（ESI温度、电压、气体压力等） 阅读提示：Materials and methods: Untargeted plasma metabolomic analysis; Targeted LC-MS/MS |
| 宏基因组分析 | 测序平台（Illumina NovaSeq）、文库构建试剂盒、数据分析流程（Fastp质控、MEGAHIT组装、基因预测等） 阅读提示：Materials and methods: Metagenome sequencing |
