临床样本微塑料检测
确认结直肠癌患者肿瘤组织和血液中是否存在微塑料，并分析其特征。
采用LDIR和Py-GC/MS技术对患者肿瘤组织和血液样本进行微塑料检测，分析其类型、尺寸分布、形态及浓度，并评估与患者生存期的相关性。
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肿瘤浸润微塑料破坏JAK-STAT-微生物群轴促进结直肠癌免疫治疗耐药
Tumour-infiltrating microplastics disrupt the JAK-STAT-microbiota axis to promote immunotherapy resistance in colorectal cancer
实验完整度
高包含临床样本检测、细胞实验、两种动物模型、转录组与16S rRNA测序等多层级证据，并有功能验证与机制研究。
主要模型
HCT116、SW480、CT26、MC38结直肠癌细胞系 AOM-DSS诱导的原位结直肠癌小鼠模型 CT26皮下移植瘤小鼠模型 结直肠癌患者肿瘤组织和血液样本
重点核对
微塑料暴露剂量：200 mg/mL聚苯乙烯微塑料溶液，经饮水给予； 动物模型：AOM-DSS原位模型及CT26皮下移植瘤模型，均使用BALB/c小鼠； 抗PD-L1治疗：200 μg/只/次，每3天一次，原位模型共5次，皮下模型共6次； 微塑料摄取机制：主要通过网格蛋白介导的内吞作用，抑制剂Pitstop 2和Dynasore可阻断摄取； 微塑料暴露时间：原位模型暴露超过10周，皮下模型暴露14天。
摘要
微塑料是全球普遍存在的环境污染物。虽然其潜在健康影响已得到承认，但其与癌症的关联仍不清楚。结直肠是微塑料的主要吸收部位，进一步探索微塑料对结直肠癌进展和免疫治疗疗效的影响是有必要的。在本研究中，从结直肠癌肿瘤组织和血液中分离出微塑料，并检测了其特性。微塑料在动物模型中加重了结直肠癌的严重程度并促进了免疫治疗耐药。此外，微塑料摄取抑制了JAK-STAT通路；下调IFN-γ、CXCL9、CXCL11、B2m和H2-K1的表达；减少了CD8+和CD4+ T细胞浸润；并增加了肿瘤对免疫治疗的耐药性。微塑料还引发了肠道菌群失调，显著促进了结直肠癌免疫治疗耐药。微塑料通过改变肿瘤免疫微环境在结直肠癌免疫治疗耐药中发挥重要作用，并代表结直肠癌免疫治疗的一个新靶点，尤其是在微塑料污染日益严重的背景下。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 微塑料在结直肠癌进展和免疫治疗疗效中的作用及机制是什么？
- 核心机制
- 微塑料通过网格蛋白介导的内吞作用进入细胞，主要积聚在溶酶体，抑制JAK-STAT通路（JAK2、STAT1、STAT3磷酸化），下调IFN-γ及其靶基因（CXCL9、CXCL11、B2m、H2-K1）表达，减少CD8+和CD4+ T细胞浸润，同时诱导肠道菌群失调，共同导致免疫治疗耐药。
- 主要证据
- 在人结直肠癌组织和血液中检测到微塑料；动物模型（原位和皮下）显示微塑料加重肿瘤并抵抗抗PD-L1治疗；转录组测序和Western blot显示JAK-STAT通路抑制；多重免疫荧光显示T细胞浸润减少；16S rRNA测序显示菌群失调。
- 研究意义
- 研究首次揭示微塑料通过JAK-STAT通路损害结直肠癌免疫治疗疗效，提示阻断微塑料摄取可能成为新的精准治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞摄取与亚细胞定位
探究结直肠癌细胞对聚苯乙烯微塑料的摄取机制及在细胞内的分布。
使用荧光标记的PS-MPs（Cy5-MPs）与人结直肠癌细胞系（HCT116、SW480）和小鼠细胞系（CT26、MC38）共培养，通过激光共聚焦显微镜观察MPs与溶酶体和线粒体的共定位，并通过内吞抑制剂评估摄取途径。
动物模型建立与免疫治疗评估
评估长期微塑料暴露对结直肠癌进展及抗PD-L1免疫治疗疗效的影响。
建立AOM-DSS诱导的结直肠癌原位模型和CT26皮下移植瘤模型，分别给予微塑料或水，并在模型后期进行抗PD-L1治疗，比较肿瘤负荷、体重变化及病理损伤。
转录组与信号通路分析
揭示微塑料诱导免疫治疗耐药的分子机制，特别是JAK-STAT通路的变化。
对原位肿瘤组织进行RNA-seq，分析差异表达基因和通路；用Western blot、RT-qPCR和ELISA验证JAK-STAT通路关键蛋白和细胞因子表达。
功能验证
验证JAK-STAT通路在微塑料诱导免疫抑制中的作用。
使用JAK-STAT激动剂2-NP或构建STAT1组成性激活的过表达细胞系，评估能否逆转微塑料对JAK-STAT通路和IFN-γ靶基因的抑制作用。
T细胞浸润与免疫微环境评估
评估微塑料对肿瘤组织中CD8+和CD4+ T细胞浸润及功能的影响。
对原位和皮下肿瘤组织进行多重免疫荧光染色，检测CD4、CD8、IFN-γ和GZMB表达，量化T细胞浸润水平。
肠道菌群分析
探究微塑料暴露对结直肠癌小鼠肠道菌群组成和多样性的影响。
收集小鼠粪便，进行16S rRNA基因测序，分析菌群多样性、组成差异及功能预测。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证免疫效应
验证机制链路
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 微塑料检测 | 8700 LDIR化学成像系统 | Agilent Technologies | -- |
| 热裂解-气相色谱/质谱系统 | Shimadzu | QP2020NX, | |
| 微塑料表征 | 多角度粒度及高灵敏度Zeta电位分析仪 | Brookhaven | NanoBrook |
| 微塑料摄取 | 蔡司LSM 900 + Airyscan2激光共聚焦显微镜 | Zeiss | LSM |
| 微塑料表征 | 透射电子显微镜 | Hitachi | HT-7800 |
| 活体成像 | IVIS SPECTRUM小动物活体光学成像系统 | Perkin Elmer | -- |
| 组织学分析 | Akoya Vectra Polaris全组织多色荧光定量成像系统 | Akoya | -- |
| Western blot | ChemiDoc成像系统 | Bio-Rad | -- |
| RT-qPCR | NanoDrop One分光光度计 | Thermo Scientific | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 细胞摄取 | Hoechst 33342染料 | Yeasen | 40731ES10 |
| 溶酶体绿色荧光探针 | Yeasen | 40738ES50 | |
| 线粒体绿色荧光探针 | Yeasen | 40742ES50 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime Biotechnology | P0013B |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | New Cell & Molecular Biotech | P002 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Biotechnology | P0012S | |
| SDS-PAGE凝胶 | ACE Biotechnology | ET15412Gel | |
| PVDF膜 | Beyotime Biotechnology | FFP39 | |
| 抗体稀释液 | New Cell & Molecular Biotech | WB500D | |
| ECL化学发光检测试剂盒 | New Cell & Molecular Biotech | P10300 | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| Evo M-MLV逆转录预混试剂盒 | Accurate Biotechnology | AG11728 | |
| SYBR Green Pro Taq HS预混qPCR试剂盒 | Accurate Biotechnology | AG11718 | |
| 药物处理 | 氧化偶氮甲烷 | MP Biomedicals | 183971 |
| 右旋糖酐硫酸钠 | MCE | HY-116282 | |
| Dynasore（发动蛋白抑制剂） | MCE | HY-15304 | |
| Pitstop 2（网格蛋白抑制剂） | MCE | HY-115604 | |
| EIPA（Na+/H+交换抑制剂） | MCE | HY-101840 | |
| 2-NP（JAK-STAT激动剂） | MCE | HY-W013523 | |
| 免疫治疗 | 抗小鼠PD-L1 (B7-H1) InVivo抗体 | Selleck | A2115 |
| Western blot | 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig |
| 抗JAK2抗体 | Abcam | ab108596 | |
| 抗磷酸化JAK2 (Tyr1007/1008)抗体 | Abcam | ab32101 | |
| 抗STAT1抗体 | Cell Signaling Technology | 14994 | |
| 抗磷酸化STAT1 (Tyr701)抗体 | Cell Signaling Technology | 9167 | |
| 抗STAT3抗体 | Abcam | ab68153 | |
| 抗磷酸化STAT3 (Tyr705)抗体 | Abcam | ab76315 | |
| 免疫组化 | 抗Ki67抗体 | Abiowell | AWA11025 |
| 免疫荧光 | 抗CD4抗体 | Abcam | ab183685 |
| 抗CD8抗体 | Abcam | ab217344 | |
| 抗GZMB抗体 | Abcam | ab255598 | |
| 抗IFN-γ抗体 | Proteintech | 29788 | |
| 微塑料处理 | 聚苯乙烯微塑料（50 nm） | Jiangsu Zhichuan Technology Co., Ltd. | -- |
| 荧光标记Cy5微塑料 | Jiangsu Zhichuan Technology Co., Ltd. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本微塑料检测 | 样本来源、患者纳入标准、LDIR检测条件（如消化时间、温度、MQ阈值、粒径范围）和Py-GC/MS检测条件（如裂解温度、色谱柱、升温程序）需核对。 阅读提示：Materials and methods 中 Sample collection, Laser direct infrared (LDIR) imaging, Pyrolysis‒gas chromatography/mass spectrometry (Py‒GC‒MS) 部分 |
| 细胞摄取实验 | 细胞系（HCT116、SW480、CT26、MC38）及其来源、培养条件、MP-Cy5浓度、共培养时间、内吞抑制剂（Pitstop 2、Dynasore）及浓度、溶酶体/线粒体探针及浓度。 阅读提示：Materials and methods 中 Cell culture, Cell uptake and localization 部分 |
| 动物模型 | 动物品系、性别、年龄、体重、造模方法（AOM剂量、DSS浓度及周期）、微塑料暴露浓度（200 mg/mL）及途径（饮水）、抗PD-L1抗体剂量（200 μg/只）及给药方案（次数、间隔）、各组动物数量（原位n=6，皮下n=5）。 阅读提示：Materials and methods 中 Mouse orthotopic tumour model, Mouse subcutaneous tumour model 部分 |
| 分子检测 | Western blot 中蛋白上样量（20 μg）、抗体稀释比例、孵育条件和内参（GAPDH）；RT-qPCR 中引物序列、内参基因；ELISA 中标准品稀释和操作步骤。 阅读提示：Materials and methods 中 Western blot analysis, RT-qPCR analysis, ELISA 部分 |
| 组织学与免疫荧光 | 组织固定、脱水、包埋、切片厚度（4 μm）、抗原修复方法（EDTA或枸橼酸缓冲液）、一抗孵育条件、TSA染料使用顺序。 阅读提示：Materials and methods 中 Histological analysis, Multiplex immunofluorescence staining 部分 |
| 16S rRNA测序 | 粪便样本采集时间点、DNA提取方法、PCR扩增引物（如515F/806R）、测序平台、生物信息学分析流程（QIIME2参数）。 阅读提示：Materials and methods 中 16S rRNA sequencing analysis 部分 |