培养皮肤成纤维细胞用于血液系统疾病种系遗传检测的可行性与局限性

Feasibility and limitations of cultured skin fibroblasts for germline genetic testing in hematologic disorders

作者信息Lia DeRoin, Marcela Cavalcante de Andrade Silva, Kristin Petras, Kelly Arndt, Nathaniel Phillips, Pankhuri Wanjari, Hari Prasanna Subramanian, David Montes, James McElherne, Megan Theissen, Renee Briese, Soma Das, Lucy A Godley, Jeremy Segal, Daniela Del Gaudio, Carrie Fitzpatrick, Jane E Churpek

PMID35419889

期刊Hum Mutat

发布时间2022-07

DOI10.1002/humu.24374

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实验完整度

中

研究为回顾性队列研究，包含皮肤成纤维细胞培养、NGS变异检测、验证及统计分析，但无功能实验或机制研究。

主要模型

皮肤成纤维细胞培养样本血液或骨髓样本

重点核对

活检至培养启动时间（当天 vs 延迟）是否存在端粒相关基因（PARN、RTEL1、TERC、TERT）杂合致病性变异活检样本大小是否接受过异基因造血干细胞移植疾病类型（淋巴系 vs 髓系）

摘要

为避免血液中出现的获得性变异，培养的皮肤成纤维细胞被认为是血液系统疾病患者种系遗传检测的推荐DNA来源，但关于其实用性和局限性的数据缺乏。我们进行了一项回顾性队列研究，研究对象为350名接受皮肤成纤维细胞培养以进行种系遗传检测的血液系统疾病患者。我们分析了144个遗传性癌症和骨髓衰竭基因靶向捕获的下一代测序数据，以识别杂合和亚克隆变异等位基因频率的变异。16例（5%）活检样本培养失败。培养失败更可能发生在培养启动延迟（OR=4.3；p<0.01）或存在端粒基因致病性变异的样本中（OR=42.6；p<0.01）。中位培养时间为28天（IQR 22−29天）。先前接受过异基因干细胞移植的受试者培养时间更长（+10.7%；p=0.02），而携带杂合致病性变异的受试者（−11.9%；p<0.01）、活检样本更大（−10.6%；p<0.01）或患有淋巴系恶性肿瘤（−8.4%；p<0.01）的受试者培养时间更短。在10例（4%）中发现了亚克隆变异，在8例中5例（56%）有替代样本可供确认。亚克隆和不一致变异表明，从培养的皮肤成纤维细胞进行种系检测需要表型相关性分析，在罕见情况下，需要后续研究以进行最佳解读。

皮肤活检及成纤维细胞培养

建立用于种系DNA检测的成纤维细胞培养物，评估培养成功率及培养时间。

对350名血液病患者进行皮肤活检（3mm punch或皮肤椭圆），使用标准化方案进行培养，记录培养失败和从培养启动到DNA提取的时间。

NGS靶向测序及变异分析

鉴定杂合和亚克隆致病性/可能致病性变异。

对培养的成纤维细胞DNA进行144个基因靶向捕获NGS，分析VAF 40%–60%（杂合）和10%–40%（亚克隆）的变异，并根据ACMG/ClinGen指南分类。

变异验证及跨组织比较

验证培养成纤维细胞中检出的P/LP变异，并比较与其他组织（血液、骨髓、二次皮肤活检）的一致性，以评估假阳性和亚克隆变异的临床意义。

使用Sanger测序、qPCR或aCGH验证变异；对有可用样本的病例，通过NGS评估血液或骨髓中的VAF；对亚克隆或临床不匹配的变异进行重复皮肤活检培养。

统计分析

识别与培养失败和培养时间相关的临床、技术和遗传因素。

使用Fisher精确检验、逻辑回归、t检验、Mann Whitney U检验和线性回归模型评估关联。

实验环节	名称	品牌	货号
皮肤活检与培养	T75培养瓶	--	--
RPMI培养基	--	--
变异验证	OncoPlus	--	--

实验环节

名称

品牌

货号

皮肤活检与培养

T75培养瓶

RPMI培养基

变异验证

OncoPlus

环节	核对要点
成纤维细胞培养	活检至培养启动的时间（当天、次日、≥2天），培养失败定义（未达到T75瓶80%融合度），皮肤活检部位（臀部骨髓活检切口、上臂内侧、肩胛骨等），皮肤样本运输方式（外部机构隔夜运输）阅读提示：Methods 2.2，Results 3.2和3.3，Table 1
基因检测与变异分析	基因面板范围（144个基因），VAF分析范围（杂合40%-60%，亚克隆10%-40%），变异分类标准（ACMG/AMP，ClinGen），是否排除携带者变异（常染色体隐性遗传）阅读提示：Methods 2.4，2.5，Results 3.5和3.6
变异验证与跨组织比较	验证方法（Sanger测序、qPCR、aCGH），替代组织类型（血液、骨髓、重复皮肤活检），亚克隆变异确证标准（NGS检测到且VAF范围）阅读提示：Methods 2.5，Results 3.5和3.6，图2和图3
统计分析	培养失败相关因素（端粒基因变异、活检部位、培养启动时间），培养时间相关因素（年龄、异基因移植、活检大小、疾病类型、杂合P/LP变异）阅读提示：Results 3.3和3.4，Tables 1和2

环节

核对要点

成纤维细胞培养

活检至培养启动的时间（当天、次日、≥2天），培养失败定义（未达到T75瓶80%融合度），皮肤活检部位（臀部骨髓活检切口、上臂内侧、肩胛骨等），皮肤样本运输方式（外部机构隔夜运输）

阅读提示：Methods 2.2，Results 3.2和3.3，Table 1

基因检测与变异分析

基因面板范围（144个基因），VAF分析范围（杂合40%-60%，亚克隆10%-40%），变异分类标准（ACMG/AMP，ClinGen），是否排除携带者变异（常染色体隐性遗传）

阅读提示：Methods 2.4，2.5，Results 3.5和3.6

变异验证与跨组织比较

验证方法（Sanger测序、qPCR、aCGH），替代组织类型（血液、骨髓、重复皮肤活检），亚克隆变异确证标准（NGS检测到且VAF范围）

阅读提示：Methods 2.5，Results 3.5和3.6，图2和图3

统计分析

培养失败相关因素（端粒基因变异、活检部位、培养启动时间），培养时间相关因素（年龄、异基因移植、活检大小、疾病类型、杂合P/LP变异）

阅读提示：Results 3.3和3.4，Tables 1和2

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