鉴定LDLR为潜在受体
筛选能促进GETV感染的宿主膜蛋白。
用150个膜蛋白质粒文库转染HEK 293T细胞，感染rGETV-mCherry，发现LDLR和TIMD4增强感染。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
LDLR被多种甲病毒用作细胞进入受体
LDLR is used as a cell entry receptor by multiple alphaviruses
实验完整度
高包含细胞系过表达、基因敲除、病毒结合内化实验、重组蛋白互作、抗体阻断、小鼠体内保护实验及关键氨基酸突变分析，且有多重验证。
主要模型
HEK 293T细胞系 BHK-21细胞系 ST和LLC-PK1猪细胞系 ICR小鼠模型
重点核对
HEK 293T细胞中过表达LDLR可促进GETV等多种甲病毒假病毒感染 CRISPR-Cas9敲除BHK-21细胞中Ldlr或Mxra8可减少rGETV-EGFP感染 GST-LBD融合蛋白在体外和体内阻断GETV感染 LDLR-LBD的CR5中D226K突变显著降低病毒进入
摘要
甲病毒是由蚊子传播的虫媒病毒，对人类和家畜具有致病性，造成重大的公共卫生负担。到目前为止，已经鉴定出几种甲病毒进入的受体；然而，它们不能解释某些甲病毒（如盖塔病毒（GETV））的广泛宿主范围和组织嗜性，表明存在额外的受体。在这里，我们确定了进化上保守的低密度脂蛋白受体（LDLR）作为GETV、塞姆利基森林病毒（SFV）、罗斯河病毒（RRV）和贝巴鲁病毒（BEBV）的新细胞进入因子。LDLR的异位表达促进了GETV的细胞结合和内化，这是由GETV的E2-E1刺突与LDLR的配体结合域（LBD）之间的相互作用介导的。针对LBD的抗体在培养细胞中阻断GETV感染。此外，GST-LBD融合蛋白在体外和体内均抑制GETV感染。值得注意的是，我们确定了LDLR-LBD中对病毒进入起关键作用的关键氨基酸；LDLR-LBD的CR4和CR5结构域中的特定突变将病毒进入细胞的能力降低20倍以上。这些发现表明，靶向LDLR-LBD可能是开发针对多种甲病毒的抗病毒药物的潜在策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 甲病毒如何利用LDLR作为细胞进入受体，以及LDLR的哪个结构域和氨基酸残基参与病毒结合与进入。
- 核心机制
- LDLR通过与GETV的E2-E1刺突蛋白相互作用介导病毒进入，其关键性依赖于LBD中的CR4和CR5结构域，特别是CR5中的特定氨基酸残基。
- 主要证据
- 通过过表达、敲除、结合和内化实验证明LDLR促进病毒感染；通过GST-LBD pull-down、ELISA和BLI证明LBD与E2-E1直接结合；通过抗体阻断和突变分析确定关键功能域。
- 研究意义
- LDLR作为多种甲病毒的受体可解释其广泛宿主范围，靶向LDLR-LBD有望开发防治甲病毒感染的新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证LDLR促进多种甲病毒感染
确认LDLR过表达能促进GETV及其他甲病毒的感染。
用表达LDLR、LDLRAD3或MXRA8的HEK 293T稳定细胞系感染EGFP假病毒，检测GFP阳性细胞比例。
证明LDLR参与病毒结合和内化
明确LDLR在病毒进入过程中的作用。
进行病毒结合（4°C）和内化（37°C）实验，检测vRNA水平，并用共聚焦显微镜观察病毒颗粒与受体的共定位。
基因敲除验证LDLR必要性
验证LDLR在生理水平上对GETV感染的影响。
用CRISPR-Cas9在BHK-21和猪细胞系中敲除Ldlr和/或Mxra8，感染rGETV-EGFP，检测感染效率。
定位LDLR中与GETV结合的功能域
确定LDLR的哪个结构域与GETV E2-E1相互作用。
构建LDLR截短突变体（ΔLBD和ΔEGF）并检测其支持感染的能力，同时用GST-LBD pull-down、ELISA和BLI验证LBD与E2-E1的直接结合。
评估阻断策略的体内外效果
验证可溶性LBD或抗LDLR抗体是否能阻断GETV感染。
用GST-LBD或抗LDLR血清预处理病毒或细胞，检测感染抑制；在小鼠模型中给予GST-LBD，观察保护效果。
鉴定关键氨基酸残基
确定LDLR-LBD中影响病毒进入的关键残基。
基于结构比对，在CR5和CR4中引入点突变，检测突变体支持感染的能力。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Biological Industries | C3113-0500 |
| 胎牛血清 | Biological Industries | C04001500 | |
| Expi293表达培养基 | Thermo Fisher | -- | |
| 转染 | ExFect转染试剂 | Vazyme | T101 |
| 线性聚乙烯亚胺（PEI）MW40000 | Yeasen Biotechnology | 40816ES03 | |
| 质粒构建 | pCAGGS载体 | NovoPro | V008798 |
| pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体 | SBI Systems Biosciences | CD510B-1 | |
| pMD2.0 G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| 基因敲除 | lentiCRISPR v.2-puro | Addgene | 98290 |
| lentiCRISPR v.2-neo | Addgene | 98292 | |
| 蛋白表达 | pGEX-4T-1载体 | Cytiva | 28-9545-49 |
| pcDNA3.4载体 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| MultiF无缝组装试剂 | Abclone | RK21020 | |
| 蛋白纯化 | GST标签纯化树脂 | Beyotime | P2262 |
| 蛋白A琼脂糖 | Beyotime | P2015 | |
| Strep-Tactin XT 4Flow高容量树脂 | IBA | 2-5030-002 | |
| 蛋白浓缩 | Amicon Ultra-15 30K离心过滤器 | Millipore | UFC9030 |
| 抗体 | 抗Flag M2抗体 | Sigma | F1804 |
| 抗HA单克隆抗体 | Sigma | H3663 | |
| 抗β-肌动蛋白单克隆抗体 | Proteintech | 66009 | |
| 抗GAPDH单克隆抗体 | Proteintech | 60004 | |
| 抗GST多克隆抗体 | Proteintech | 10000-0-AP | |
| 抗LDLR兔单克隆抗体 | ABclonal | A20808 | |
| 抗mCherry（4C16）小鼠单克隆抗体 | Abmart | M40012 | |
| 检测 | HRP标记的山羊抗兔IgG | KPL | 074-1806 |
| FITC标记的山羊抗小鼠IgG Fc | Thermo Fisher | 31547 | |
| DAPI | Solarbio | 1:1000 | |
| 细胞活性 | 细胞计数试剂盒8（CCK8） | Beyotime | C0038 |
| RNA提取 | TRizol Up试剂 | TransGen Biotech | ET111-01-V2 |
| RT-qPCR | AceQ qPCR SYBR Green预混液试剂盒 | Vazyme | Q111-02 |
| cDNA合成 | Uni一步法基因组DNA去除和cDNA合成预混液 | TransGen Biotech | AU311 |
| BCA定量 | 二辛可宁酸（BCA）蛋白质定量试剂盒 | Vazyme | E112-01 |
| 免疫沉淀 | 蛋白A+G琼脂糖 | Beyotime | P2055 |
| 裂解液 | NP-40裂解液 | Beyotime | P0013F |
| 过滤 | 0.22 μm过滤器 | Millipore | SLGP033N |
| 仪器 | BD Accuri C6流式细胞仪 | BD | -- |
| TECAN Infinite M200 Pro酶标仪 | TECAN | -- | |
| Nikon A1共聚焦显微镜 | Nikon | -- | |
| Octet RED96 | Pall Fortebio | -- | |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare | -- | |
| GST生物传感器 | ForteBio | 18-5096 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源（HEK 293T、BHK-21、ST等）、培养基（DMEM+10% FBS）、培养条件（37°C，5% CO2） 阅读提示：Methods: Cells and viruses |
| 病毒制备 | 重组病毒（rGETV-EGFP等）的构建和滴度测定（TCID50） 阅读提示：Methods: Cells and viruses, Plaque assays |
| 感染实验 | 感染复数（MOI）、感染时间（1小时）、温度（37°C）、检测时间点（12-24小时） 阅读提示：Methods: Infection assay |
| 基因敲除 | sgRNA序列、细胞系（BHK-21等）、筛选标记（puromycin/neomycin） 阅读提示：Methods: Generation and validation of gene knock-outs |
| 蛋白表达和纯化 | 表达载体、宿主细胞（BL21(DE3)或Expi293F）、诱导条件（IPTG浓度、温度、时间）、纯化树脂 阅读提示：Methods: Expression and purification of recombinant proteins |
| 结合和阻断实验 | GST-LBD浓度、抗LDLR血清稀释度、预孵育时间和温度 阅读提示：Methods: Entry blocking assays |
| 小鼠实验 | 小鼠品系（ICR）、年龄（2日龄或6周龄）、接种病毒量（105或104 TCID50）、GST-LBD剂量（100 μg或700 μg）、给药途径和时间 阅读提示：Methods: Mouse experiments |