CRISPR-Cas9筛选鉴定γ-珠蛋白抑制因子
发现参与胎儿血红蛋白调控的新型转录因子。
利用靶向人类转录因子DNA结合域的sgRNA文库转导HUDEP-2-Cas9细胞，通过抗HbF FACS分离HbF高表达和低表达细胞，测序分析sgRNA富集情况。
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ZNF410独特激活NuRD组分CHD4以沉默胎儿血红蛋白表达
ZNF410 Uniquely Activates the NuRD Component CHD4 to Silence Fetal Hemoglobin Expression
实验完整度
高涵盖CRISPR筛选、细胞系及原代红细胞功能实验、异种移植体内验证、RNA-seq、ChIP-seq及晶体结构等多层级证据。
主要模型
HUDEP-2细胞 原代人类CD34+ HSPC来源的红系细胞 NBSGW小鼠异种移植模型 G1E-ER4细胞
重点核对
HUDEP-2-Cas9细胞系及sgRNA靶向ZNF410 DNA结合域 原代人CD34+ HSPCs电穿孔RNP（Cas9:sgRNA） NBSGW小鼠异种移植，每只注射0.4×10^6个CD34+ HSPCs CHD4 cDNA回补实验（约2倍过表达） 电泳迁移率变动实验（EMSA）和晶体结构分析
摘要
后生动物转录因子通常调控大量基因。在此，我们通过CRISPR-Cas9遗传筛选鉴定了ZNF410，一种五指状DNA结合蛋白，在人类红细胞中直接激活唯一一个基因，即NuRD组分CHD4。特异性由CHD4基因附近两个高度进化保守的ZNF410结合位点簇介导，这些位点在基因组其他位置没有对应物。在成人型人类红细胞培养系统和异种移植环境中，ZNF410缺失会降低CHD4水平并解除对胎儿血红蛋白基因的抑制。虽然胎儿珠蛋白基因先前已知被CHD4沉默，但此处揭示其对CHD4水平降低最为敏感。体外DNA结合实验和晶体学研究揭示了ZNF410-DNA结合模式。ZNF410是红细胞中一个高度选择性的转录激活因子，对其干扰可能为血红蛋白病的治疗提供新机会。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探索调控γ-珠蛋白表达的新的转录因子及其机制。
- 核心机制
- ZNF410通过直接激活NuRD组分CHD4基因的转录，维持CHD4水平，进而沉默胎儿血红蛋白基因表达。
- 主要证据
- CRISPR-Cas9筛选鉴定ZNF410；RNA-seq显示CHD4为ZNF410唯一直接靶基因；ChIP-seq显示ZNF410结合于CHD4基因近端和远端调控区；ZNF410缺失降低CHD4并诱导γ-珠蛋白表达；CHD4回补可恢复γ-珠蛋白沉默。
- 研究意义
- ZNF410是红细胞中高度特异的转录激活因子，可能通过靶向ZNF410提高胎儿血红蛋白表达，为血红蛋白病（如镰状细胞病和β-地中海贫血）的治疗提供新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
ZNF410缺失在细胞系和原代细胞中验证功能
确认ZNF410敲除对γ-珠蛋白表达的影响。
在HUDEP-2细胞中使用两个独立sgRNA敲除ZNF410，检测HbF阳性和γ-珠蛋白水平；在原代CD34+ HSPCs电穿孔RNP敲除ZNF410，同样检测γ-珠蛋白表达。
异种移植实验验证体内功能
在体内环境中验证ZNF410缺失对γ-珠蛋白的作用。
将ZNF410编辑或对照的CD34+ HSPCs移植到NBSGW小鼠，16周后分析骨髓中人红系细胞中HbF+比例、HbF蛋白水平和γ-珠蛋白mRNA水平。
转录组和表观基因组分析
阐明ZNF410调控γ-珠蛋白的分子机制。
对ZNF410缺失的HUDEP-2细胞和原代红细胞进行RNA-seq；对HUDEP-2细胞和原代红细胞进行ZNF410 ChIP-seq；对HUDEP-2细胞进行HA-ZNF410 ChIP-seq；对原代红细胞进行H3K27ac ChIP-seq和ATAC-seq分析。
CHD4回补实验
验证CHD4是否为ZNF410功能的关键介导者。
在ZNF410缺陷的HUDEP-2细胞中转导含CHD4 cDNA的慢病毒载体，检测γ-珠蛋白表达及全转录组变化。
DNA结合和结构分析
解析ZNF410与DNA结合的模式。
使用EMSA检测ZNF410全长和ZF结构域突变体的DNA结合活性；通过荧光偏振测定ZNF410 ZF结构域与共识基序的结合亲和力；解析ZF结构域-DNA复合物的晶体结构。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | StemSpan SFEM | -- | -- |
| IMDM培养基 | -- | -- | |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 人干细胞因子 | Peprotech | 300-07 | |
| 促红细胞生成素 | AMGEN | 55513-144-10 | |
| 地塞米松 | -- | -- | |
| 多西环素 | -- | -- | |
| 全转铁蛋白 | -- | -- | |
| 肝素 | -- | -- | |
| 胰岛素 | -- | -- | |
| 白细胞介素-3 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| 单硫代甘油 | -- | -- | |
| Kit配体 | -- | -- | |
| 雌二醇 | -- | -- | |
| PBS-EDTA | -- | -- | |
| 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| HEPES | -- | -- | |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| RIPA裂解液 | -- | -- | |
| 蛋白酶抑制剂 | Sigma | -- | |
| Lammli样品缓冲液 | -- | -- | |
| NuPAGE 4%-12% Bis-Tris蛋白胶 | Thermofisher | -- | |
| 免疫印迹 | 脱脂牛奶 | -- | -- |
| TBST缓冲液 | -- | -- | |
| 化学发光HRP底物 | Thermofisher | -- | |
| RT-qPCR | RNeasy Plus微型试剂盒 | QIAGEN | -- |
| 无RNA酶DNase试剂盒 | QIAGEN | -- | |
| iScript Supermix逆转录试剂 | Bio-Rad | 1708841 | |
| Power SYBR Green荧光染料 | ThermoFisher Scientific | 4367659 | |
| 转染 | Fu-gene 6转染试剂 | Promega | -- |
| 聚乙烯亚胺 | Polysciences | 23966-1 | |
| pVSVG包装质粒 | -- | -- | |
| psPAX2包装质粒 | -- | -- | |
| 基因编辑 | SpCas9蛋白 | IDT | -- |
| sgRNA | IDT | -- | |
| P3原代细胞4D核转染试剂盒 | Lonza | -- | |
| 流式细胞术 | HbF-APC偶联抗体 | Thermo Fisher Scientific | MHFH05 |
| 抗CD71抗体 | BioLegend | 334112 | |
| 抗CD235a抗体 | BioLegend | 349104 | |
| CD45抗体 | BD Biosciences | 560367 | |
| CD33抗体 | BioLegend | 366608 | |
| CD19抗体 | BioLegend | 302212 | |
| 免疫沉淀 | ZNF410抗体 | Proteintech | 14529-1-AP |
| HA抗体 | Sigma | 11815016001 | |
| H3K27ac抗体 | Abcam | ab4729 | |
| ChIP-seq | TruSeq ChIP-seq样品制备试剂盒 | Illumina | IP-202-1012 |
| Dynabeads蛋白A磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 10002D | |
| Dynabeads蛋白G磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 10004D | |
| RNA-seq | ScriptSeq完整试剂盒 | Illumina | BHMR1224 |
| Ribo-Zero去除试剂 | Illumina | -- | |
| HPLC | 日立D-7000系列高效液相色谱仪 | Hitachi Instruments | -- |
| Poly CAT A弱阳离子交换柱 | Poly LC | -- | |
| 血红蛋白标准品 | Helena Laboratories | -- | |
| 形态学染色 | May-Grünwald染液 | Sigma Aldrich | -- |
| 吉姆萨染液 | Sigma Aldrich | -- | |
| Cytospin4细胞涂片离心机 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 显微镜观察 | 奥林巴斯BX60显微镜 | Olympus | -- |
| 蛋白质纯化 | GSTrap亲和层析柱 | GE Healthcare | -- |
| 肝素亲和层析柱 | GE Healthcare | -- | |
| HiLoad 16/60 Superdex S200凝胶过滤柱 | GE Healthcare | -- | |
| PreScission蛋白酶 | -- | -- | |
| 谷胱甘肽 | -- | -- | |
| 三(2-羧乙基)膦 | -- | -- | |
| 聚乙烯亚胺 | -- | -- | |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 | -- | -- | |
| 结晶实验 | 甲酸铵 | -- | -- |
| 聚乙二醇3350 | -- | -- | |
| 乙二醇 | -- | -- | |
| DNA结合实验 | FAM标记DNA双链 | -- | -- |
| Synergy 4酶标仪 | BioTek | -- | |
| GST-ZF1-ZF5融合蛋白 | -- | -- | |
| TBE缓冲液 | -- | -- | |
| ChemiDoc成像系统 | BIO-RAD | -- | |
| EMSA | Quick Spin离心柱 | Roche | -- |
| Typhoon FLA 9500激光扫描仪 | FUJIFILM | -- | |
| 富士胶片BAS CASETTE2 2025磷屏 | FUJIFILM | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRISPR筛选 | HUDEP-2-Cas9细胞、sgRNA文库（平均6个sgRNA/基因）、MOI 0.3-0.5、感染后8天开始分化培养7天、HbF高/低群体分选 阅读提示：CRISPR sgRNA library generation and screen部分 |
| 细胞培养与分化 | HUDEP-2细胞维持培养基（StemSpan SFEM + 50 ng/ml SCF + 10 μM地塞米松 + 1 μg/ml多西环素 + 3 IU/ml EPO）、分化培养基（IMDM + 50 ng/ml SCF + 3 IU/ml EPO + 250 μg/ml转铁蛋白等）、分化时间6-7天；原代CD34+ HSPC三阶段培养（Phase I: SCF, IL-3, 转铁蛋白; Phase II: SCF, 转铁蛋白; Phase III: 转铁蛋白） 阅读提示：Cell lines部分 |
| 基因敲除 | RNP电穿孔（100 pmol sgRNA + 50 pmol Cas9蛋白）、电穿孔程序DZ100、CD34+ HSPCs第3-4天使用 阅读提示：RNP electroporation部分 |
| 异种移植 | NBSGW小鼠（8-12周龄）、每只注射0.4×10^6细胞、尾静脉注射、16周后分析骨髓 阅读提示：In vivo transplantation of CD34+ HSPCs部分 |
| CHD4回补 | ZNF410缺陷的HUDEP-2细胞、CHD4 cDNA慢病毒载体（含IRES-GFP）、FACS分选GFP+、CHD4 mRNA水平约2倍正常 阅读提示：Figure 3E和结果部分 |
| ChIP-seq | 抗体（ZNF410、HA、H3K27ac）、交联（1%甲醛10分钟）、裂解、超声、免疫沉淀、文库制备、测序 阅读提示：ChIP-seq部分 |
| EMSA | COS-7细胞核提取物、FLAG-ZNF410过表达、放射性标记探针、6%聚丙烯酰胺凝胶、TBE缓冲液、250V电泳1h45min 阅读提示：EMSAs部分 |
| 蛋白质纯化与结晶 | GST-ZF1-ZF5在大肠杆菌BL21中表达、IPTG诱导、三柱纯化（GST亲和、肝素、凝胶过滤）、结晶条件（0.2 M甲酸铵、20% PEG3350）、衍射数据收集（APS 22-ID光束线） 阅读提示：Protein expression and purification和Crystallography部分 |
| RNA-seq | 总RNA提取、文库构建（ScriptSeq Complete Kit）、rRNA去除、测序（NextSeq 500，2×76bp）、数据分析（STAR比对、RSEM定量、DESeq2差异分析） 阅读提示：RNA-Seq和RNA-Seq data analysis部分 |