单细胞转录组图谱分析
绘制CROM的细胞图谱，识别关键细胞亚群
对6例CROM患者的13个样本进行scRNA-seq，并与公共数据整合，共155,163个细胞，识别9种主要细胞类型。
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AKT3驱动的上皮-间质转化可塑性通过肿瘤微环境重塑调控结直肠癌卵巢转移
AKT3-Driven Epithelial-Mesenchymal Plasticity Governs Ovarian Metastasis in Colorectal Cancer via Tumor Microenvironment Remodeling
实验完整度
高包含scRNA-seq及bulkRNA-seq多组学分析，细胞系功能实验（增殖、迁移、侵袭、周期），动物模型（卵巢转移异种移植），PDO模型，以及多重免疫荧光和IHC临床样本验证，具备多证据层级和功能验证。
主要模型
HT29细胞系 SW480细胞系 患者来源的CROM类器官（CROM-PDO） 卵巢转移异种移植小鼠模型（NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl小鼠）
重点核对
AKT3敲低细胞系（shAKT3-1/2）及恢复表达细胞系（shAKT3-OE）的构建与验证 细胞活力检测（MTS法）和处理时间（24, 72小时） Transwell侵袭实验中的Matrigel包被比例（1:8）和侵袭时间（48小时） 体内实验中每组小鼠数量（n=10）及腹腔注射细胞数（5×10^5） 类器官培养中Matrigel包埋和培养时间（每1-2周传代）
摘要
结直肠癌卵巢转移（CROM）是结直肠癌的一种独特转移亚型，与疾病早发和侵袭性进展相关。CROM缺乏特异性治疗选择，凸显了阐明其潜在生物学机制和潜在治疗脆弱性的必要性。在本研究中，我们对来自本中心队列和公共数据集的35例患者的155,163个细胞进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集的整合分析，并匹配了批量转录组分析。该分析确定位于侵袭性肿瘤-基质界面的AKT3+上皮-间质转化（EMT）样细胞为转移起始细胞。使用体内异种移植模型的功能验证表明，AKT3缺失减少了卵巢定植，而AKT3过表达赋予了具有侵袭能力的间质表型。此外，AKT3+间质样细胞与癌症相关成纤维细胞（CAF）之间的相互串扰在重塑肿瘤微环境中发挥了关键作用。原发肿瘤标本的多重免疫荧光染色显示，在侵袭前沿，AKT3+/SNAIL+/ITGB1+肿瘤芽与αSMA+ CAF相邻，呈空间协调分布。重要的是，在患者来源的CROM类器官（CROM-PDO）中，AKT3抑制或敲低显著抑制了恶性表型，重现了AKT3依赖性。总之，这些发现阐明了AKT3驱动的将EMT可塑性与CAF激活偶联的正反馈环路是CROM的关键驱动因素，并提出了CROM-PDO作为开发针对这种侵袭性结直肠癌亚型的精准疗法的可靠平台。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在揭示结直肠癌卵巢转移（CROM）的分子机制及潜在治疗靶点，特别是寻找驱动CROM的特定恶性细胞亚群及其与肿瘤微环境（TME）的相互作用。
- 核心机制
- AKT3驱动的上皮-间质转化（EMT）可塑性通过正反馈环路与癌症相关成纤维细胞（CAF）激活相互作用，促进肿瘤微环境重塑，从而驱动CROM的发生发展。
- 主要证据
- 单细胞和批量转录组分析鉴定AKT3+ EMT样细胞为转移起始细胞；体外细胞实验（增殖、迁移、侵袭）和体内异种移植模型验证AKT3功能；多重免疫荧光显示AKT3+/SNAIL+/ITGB1+肿瘤芽与αSMA+ CAF空间共定位；CROM-PDO实验证实AKT3依赖性。
- 研究意义
- 本研究为CROM的发病机制提供了重要见解，并建立了CROM-PDO模型，为开发针对这一侵袭性结直肠癌亚型的精准治疗策略奠定了平台。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
上皮细胞亚群鉴定及EMT样细胞特征分析
鉴定驱动CROM的恶性上皮亚群及其功能特征
对12,937个上皮细胞进行亚聚类，鉴定14个亚群，其中EMT样细胞具有部分EMT状态，富集ECM重塑和细胞连接调控通路。
AKT3作为EMT样细胞关键调控因子的鉴定
验证AKT3在EMT样细胞中的表达及临床相关性
通过信号通路分析、差异表达分析和外部数据集验证AKT3在EMT样细胞中显著上调，并与不良预后相关。
AKT3功能获得和丧失实验（体外）
评估AKT3对结直肠癌细胞恶性表型的影响
在HT29和SW480细胞中敲低或过表达AKT3，检测增殖、克隆形成、迁移、侵袭及细胞周期变化。
AKT3在CROM-PDOs中的功能验证
在患者来源类器官中验证AKT3的依赖性
使用CROM-PDOs进行AKT3敲低和抑制剂处理，检测增殖、活力和EMT相关基因表达。
体内卵巢转移模型验证
验证AKT3在CROM形成中的作用
将不同AKT3表达水平的HT29细胞注入雌性小鼠腹腔，评估卵巢转移发生率。
肿瘤微环境分析及CAF相互作用
阐明CAF与EMT样细胞的相互作用及TME重塑机制
分析CAF亚群，利用CellChat推断配体-受体互作，并采用mIHC验证空间关系。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
验证机制链路
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 单细胞RNA文库制备 | GemCode单细胞仪器 | 10x Genomics | -- |
| 单细胞3'文库和凝胶珠试剂盒V3.1 | 10x Genomics | -- | |
| C1000 Touch热循环仪 | Bio-Rad | -- | |
| SPRIselect试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 单细胞RNA测序 | Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
| 组织解离 | RPMI-1640培养基 | Gibco | -- |
| gentle MACS组织处理器 | Miltenyi | -- | |
| 红细胞裂解液 | Miltenyi | -- | |
| 细胞培养 | McCoy's 5A培养基 | -- | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| PDO培养 | Matrigel基质胶 | -- | -- |
| TrypLE Express酶 | Gibco | #12604013 | |
| 质粒构建与转导 | 聚凝胺 | MCE | HY-112735 |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 随机引物 | TAKARA | RR047A | |
| Light Cycler 480 II实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| 细胞增殖检测 | MTS试剂盒 | Promega | G3581 |
| 划痕实验 | 培养插入件 | Ibidi | 80209 |
| Transwell实验 | 24孔Transwell插入件（8μm孔径膜） | Corning | -- |
| Western blot | 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore | -- |
| 抗AKT3抗体 | ABclonal | A22738 | |
| 磷酸化TSC2兔多抗 | ABclonal | AP0866 | |
| 磷酸化GSK3β兔单抗 | ABclonal | AP1088 | |
| 磷酸化Bad兔单抗 | ABclonal | AP1371 | |
| 磷酸化FOXO1/FOXO3A/FOXO4兔多抗 | ABclonal | AP0892 | |
| 抗GAPDH抗体 | ABclonal | AC035 | |
| PDO活力检测 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | G7571 |
| 细胞周期检测 | 细胞周期检测溶液 | DOJINDO | C549 |
| BD LSRFortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 免疫荧光 | 肌动蛋白示踪红-594 | Beyotime Biotechnology | C2205S |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1005 | |
| 共聚焦显微镜 | Leica TCS SP8共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| 动物实验 | 小动物活体成像系统（IVIS）Spectrum-CT | PerkinElmer | -- |
| mIHC | Pan-CK抗体 | 中杉金桥 | ZM-0069 |
| CD20抗体 | Abclonal | A4893 | |
| CD68抗体 | Abclonal | A23205 | |
| CD3抗体 | Abclonal | A26443 | |
| AKT3抗体 | Proteintech | 21641-1-AP | |
| SNAIL抗体 | Abclonal | A11794 | |
| ITGB1抗体 | Abclonal | A22599 | |
| αSMA抗体 | Abclonal | A2235 | |
| Vectra Polaris系统 | Akoya Biosciences | -- | |
| inForm (v2.4.8)软件 | Akoya Biosciences | -- | |
| IHC | DAB染色液试剂盒 | Gene Tech | GK600705 |
| 奥林巴斯SLIDEVIEW VS200数字切片扫描仪 | Olympus | -- | |
| HALO图像分析软件 | Indica Labs | -- | |
| 细胞分选 | BD Melody流式细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
| 细胞计数 | Countstar自动细胞计数仪 | Countstar | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| scRNA-seq样本处理 | 组织解离程序（gentle MACS程序37C_m_TDK_1）、细胞过滤标准（基因数150-6000，线粒体RNA<10%）、文库制备试剂盒（10x Genomics V3.1） 阅读提示：Methods：Processing of human tissues and cell sorting for scRNA-seq；Single-cell RNA library preparation and sequencing |
| 细胞培养 | HT29和SW480细胞培养基（McCoy's 5A和DMEM）、FBS浓度（10%）、青霉素/链霉素浓度（100 U/mL） 阅读提示：Methods：Cell lines and cell culture |
| AKT3敲低/过表达 | shRNA序列（shAKT3-1: GAGGAGAGAATGAATTGTAGT; shAKT3-2: GGCACACACTCTAACTGAAAG）、慢病毒转导（polybrene浓度，未明确）、筛选抗生素（puromycin） 阅读提示：Methods：Plasmid and lentiviral construction and transduction |
| 细胞增殖检测 | MTS法检测时间点（24和72小时）、波长（570 nm） 阅读提示：Methods：Cell proliferation assays |
| 细胞迁移和侵袭 | 划痕实验细胞密度（2×10^5 cells/well）、检测时间点（0、24、48小时）；Transwell实验细胞密度（2×10^5 cells/well）、Matrigel稀释比例（1:8）、侵袭时间（48小时） 阅读提示：Methods：Wound healing assay；Transwell assay |
| 体内卵巢转移模型 | 小鼠品系（NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl）、周龄（6周）、细胞注射数（5×10^5）、注射方式（腹腔）、观察时间（20天） 阅读提示：Methods：Establishment of an ovarian metastasis xenograft model of mice |
| PDO培养 | 消化缓冲液成分（胶原酶1 mg/mL, DNase I 0.1 mg/mL, 钙氯3 mmol/L, 嘌呤霉素100 µg/mL, Y-27632 10 µmol/L）、基质胶包埋、培养培养基成分（Advanced DMEM/F12, GlutaMAX 2 mmol/L, HEPES 10 mmol/L, B27 1X, N-乙酰半胱氨酸1.25 mmol/L, A-83-01 500 nmol/L, SB202190 5 µmol/L, R-Spondin 200 ng/mL, Noggin 50 ng/mL, EGF 50 ng/mL, Wnt3a 100 ng/mL, Y-27632 10 μmol/L） 阅读提示：Methods：Tumor isolation and PDO culture |
| mIHC | 抗体稀释比例（AKT3 1:100, SNAIL 1:50, ITGB1 1:500, αSMA 1:100）、Opal荧光染料配对（如Opal 480, 520等）、信号放大系统（OPAL protocol） 阅读提示：Methods：mIHC |