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          神经肽前体VGF促进小细胞肺癌的神经内分泌分化与癌症相关成纤维细胞活化

        神经肽前体VGF促进小细胞肺癌的神经内分泌分化与癌症相关成纤维细胞活化

        Neuropeptide Precursor VGF Promotes Neuroendocrine Differentiation and Cancer-Associated Fibroblast Activation in Small Cell Lung Cancer

        作者信息Wen Ding, Jianzheng Zhu, Jianshan Mo, Shumin Ouyang, Guopin Liu, Yingxue Su, Danyuan Sun, Jiangling Ye, Yanle Wu, Jiayu Yan, Menghan Xue, Peibin Yue, Jin-Jian Lu, Libin Wang, Yandong Wang, Xiaolei Zhang
        PMID40857617
        期刊Cancer Res
        发布时间2025-11-14
        DOI10.1158/0008-5472.CAN-25-0405
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        包含体外细胞系模型、原代CAF共培养、体内异种移植瘤模型及患者组织样本，并进行了功能验证（增殖、凋亡、干性）和机制验证（Co-IP、ChIP-qPCR、双荧光素酶报告基因）。

        主要模型

        SCLC细胞系（NCI-H69、NCI-H128、NCI-H82、NCI-H526） 人胚肺成纤维细胞MRC-5 人原代SCLC肿瘤相关成纤维细胞(CAF) BALB/c裸鼠皮下异种移植瘤模型

        重点核对

        VGF在SCLC-A亚型中高表达，与ASCL1、CHGA表达正相关 VGF通过TOX3/CREB信号上调ASCL1转录，促进神经内分泌分化 VGF激活CAF，促进其糖酵解和乳酸分泌 SCLC细胞通过MCT1摄取乳酸，增强氧化磷酸化 SB290157和AZD3965联合用药抑制肿瘤生长

        摘要

        小细胞肺癌（SCLC）是一种高度侵袭性的恶性肿瘤，治疗选择有限。神经内分泌分化是SCLC的一个显著特征。本研究确定VGF（一种分泌型神经肽前体）是SCLC神经内分泌分化，特别是achaete-scute同源物1（ASCL1）+亚型的关键调节因子。VGF通过cAMP反应元件结合蛋白依赖性机制协调转录因子ASCL1的上调，从而促进神经内分泌分化。此外，VGF介导成纤维细胞转化为癌症相关成纤维细胞（CAF），通过乳酸交换建立SCLC细胞与CAF之间的代谢偶联。靶向VGF和单羧酸转运蛋白1的治疗策略破坏了神经内分泌分化和SCLC-CAF代谢偶联，在体外和体内模型中均显示出显著疗效。总之，本研究提供了对SCLC神经内分泌分化机制的认识，并揭示了晚期SCLC的靶点和治疗策略。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        VGF在SCLC神经内分泌分化及肿瘤微环境重塑中的作用及其机制是什么？
        核心机制
        VGF激活TOX3/CREB信号通路，上调ASCL1表达，驱动神经内分泌分化；同时通过TGFBR2/SMAD信号激活CAF，促进其糖酵解和乳酸分泌，乳酸被SCLC细胞通过MCT1摄取用于氧化磷酸化，形成代谢偶联。
        主要证据
        利用SCLC细胞系、原代CAF和异种移植瘤模型，结合基因敲低/过表达、Co-IP、ChIP-qPCR、双荧光素酶报告基因、Seahorse代谢分析等，证实VGF-TLX3/CREB-ASCL1轴及VGF-CAF-乳酸-MCT1轴的作用。
        研究意义
        揭示了VGF在SCLC神经内分泌分化和肿瘤微环境重塑中的双重作用，并提出靶向VGF和MCT1的双靶点治疗策略，为SCLC治疗提供了新方向。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        鉴定VGF为SCLC神经内分泌分化的关键调控因子

        筛选SCLC中调控神经内分泌分化的候选基因。

        通过分析GEO数据库（GSE151904、GSE242422）RNA-seq数据，筛选与ASCL1高表达和鼠SCLC肿瘤共上调的基因；通过GO富集分析鉴定VGF；在SCLC组织芯片和多个数据库中验证VGF表达及其与神经内分泌标志物的相关性。

        2

        验证VGF对SCLC神经内分泌分化及细胞功能的影响

        验证VGF是否驱动SCLC-A的神经内分泌分化，并影响细胞增殖、存活和干性。

        在SCLC-A细胞系（NCI-H69、NCI-H128）中敲低VGF，在SCLC-N/P细胞系（NCI-H82、NCI-H526）中过表达VGF，检测神经内分泌标志物（ASCL1、CHGA、SYP）的表达、细胞形态、成球能力、增殖（CCK-8和EdU）、凋亡（流式）。

        3

        阐明VGF促进神经内分泌分化的分子机制

        阐明VGF调控ASCL1表达和神经内分泌分化的分子机制。

        通过RNA-seq分析VGF敲低的差异基因，结合KEGG富集和转录因子预测，聚焦TOX3/CREB信号。Co-IP验证TOX3与CREB的相互作用，ChIP-qPCR和双荧光素酶报告基因验证CREB结合ASCL1启动子并驱动转录，并检测TLQP-21、SB290157和666-15对信号通路及神经内分泌标志物的影响。

        4

        研究VGF对CAF活化的作用及其机制

        探讨SCLC分泌的VGF能否激活CAF，并阐明其机制。

        用不同VGF表达水平的SCLC细胞培养基（CM）处理成纤维细胞（MRC-5和原代CAF），检测CAF活化标志物（αSMA、POSTN）的表达，以及TGFBR2/SMAD信号通路的激活。并通过划痕和Transwell实验检测CAF的迁移和侵袭。

        5

        验证SCLC细胞与CAF的代谢偶联

        探究活化的CAF如何通过代谢支持SCLC细胞生长。

        通过RNA-seq和GSEA分析VGF敲低对代谢通路的影响。在共培养体系中测定CAF的糖酵解能力（ECAR、乳酸分泌、糖酵解基因表达）和SCLC细胞的氧化磷酸化（OCR、ATP、乙酰辅酶A），并检测乳酸转运体MCT1/MCT4的表达。

        6

        评估体内靶向VGF和MCT1的治疗效果

        在体内验证靶向VGF和MCT1能否抑制SCLC肿瘤生长。

        建立NCI-H69（或shVGF-NCI-H69）与MRC-5共注射的皮下异种移植瘤模型，给予SB290157（10 mg/kg）、AZD3965（50 mg/kg）单药或联合治疗，检测肿瘤生长曲线、瘤重、神经内分泌标志物、MCT1表达及代谢物水平。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证分子表达变化
        实时荧光定量PCR蛋白免疫印迹免疫组织化学免疫荧光
        验证细胞功能变化
        CCK-8细胞活力检测EdU增殖检测流式细胞术凋亡检测成球实验划痕实验Transwell侵袭实验
        验证机制链路
        免疫共沉淀染色质免疫沉淀结合qPCR双荧光素酶报告基因检测RNA测序
        评估体内效果
        异种移植瘤模型
        代谢分析
        Seahorse细胞外酸化率测定Seahorse耗氧率测定乳酸浓度检测葡萄糖摄取检测
        数据分析与统计
        基因本体论富集分析KEGG富集分析基因集富集分析Pearson相关分析非配对t检验

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        细胞培养DMEM培养基Gibco10566016
        RPMI-1640培养基Gibco11875119
        胎牛血清GibcoA5669701
        青霉素-链霉素Gibco15140122
        支原体染色检测试剂盒BeyotimeC0296
        细胞鉴定GenePrint系统PromegaB9510
        蛋白检测抗ASCL1抗体Cell Signaling Technology43666
        抗CHGA抗体Zen BioScienceR26600
        抗SYP抗体Zen BioScienceR25834
        抗αSMA抗体Proteintech55135-1-AP
        抗β-actin抗体Ray AntibodyRM2001
        抗MCT1抗体Zen BioScience822667
        抗VGF抗体Zen BioScienceIHUVGFPLLY20UG
        抗裂解PARP-1抗体Cell Signaling Technology9542
        抗BCL2抗体Santa Cruz Biotechnologysc-7382
        抗裂解Caspase-7抗体Cell Signaling Technology9491
        抗SOX2抗体Cell Signaling Technology23064
        抗SLUG抗体RayBiotechDS-PB-01813
        抗磷酸化CREB抗体Affinity BiosciencesAF3189
        抗CREB抗体Santa Cruz Biotechnologysc-377154
        抗TOX3抗体RayBiotechER-14-1465
        抗POSTN抗体Affinity BiosciencesDF6746
        抗TGFBR2抗体Proteintech66636-1-Ig
        抗磷酸化SMAD2/3抗体Abcamab52903
        抗SMAD2/3抗体Cell Signaling Technology8685
        抗MCT4抗体Proteintech20889-1-AP
        免疫荧光抗Ki67抗体Abcamab15580
        蛋白检测IgG抗体MilliporeAP101
        二抗Abcamab6789
        药物处理SB290157SelleckS8931
        AZD3965SelleckS7339
        病毒构建pLKO.1-TRC载体AddgeneAddgene_110320
        病毒包装psPAX2AddgeneAddgene_12260
        PMD2.GAddgeneAddgene_12259
        Lipofectamine 2000转染试剂Thermo Fisher Scientific11668019
        Opti-MEM培养基Gibco31985070
        病毒感染聚凝胺Yeasen Biotechnology40804ES76
        稳定株筛选嘌呤霉素Yeasen Biotechnology60209ES10
        细胞活力检测CCK-8检测试剂盒BimakeB34304
        细胞凋亡检测Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒IBestBioBB-4101
        细胞增殖检测BeyoClick EdU-555增殖检测试剂盒BeyotimeC0075S
        透化Triton X-100AladdinT109027-100
        ELISAVGF ELISA试剂盒FineTest20230531
        生化检测乳酸检测试剂盒SolarbioBC2230
        蛋白提取RIPA裂解液BeyotimeP0013B
        磷酸酶抑制剂混合物SelleckB15001
        蛋白定量BCA蛋白定量试剂盒BeyotimeP0011
        封闭牛血清白蛋白BeyotimeST023
        成像ChemiDoc成像系统Tanon180-5001
        成球实验DMEM-F12培养基ProcellPM150310
        胰岛素BeyotimeP3376
        表皮生长因子PeproTechAF-100-15
        成纤维细胞生长因子PeproTech100-18B
        超低吸附培养板Corning3471
        RNA提取总RNA提取试剂Yeasen Biotechnology19201ES60
        RT-qPCRHifair II第一链cDNA合成SuperMix试剂盒Yeasen Biotechnology11123ES60
        SYBR Green染料Yeasen Biotechnology11201ES08
        CFX96实时荧光定量PCR仪Bio-Rad--
        Co-IPProtein A/G磁珠Thermo Fisher Scientific20421
        ChIP蛋白酶抑制剂混合物Roche Molecular Biochemicals05892953001
        Dynabeads Protein G磁珠Invitrogen1004D
        GeneJET凝胶回收试剂盒Thermo Fisher ScientificK0692
        双荧光素酶报告基因快速突变系统试剂盒TRANSFM111-01
        双荧光素酶报告基因检测试剂盒BeyotimeRG027
        糖摄取2-NBDG荧光葡萄糖类似物BeyotimeST2078
        代谢分析Seahorse XF细胞培养微孔板Agilent--
        Seahorse XF糖酵解压力测试Agilent--
        Seahorse XF细胞线粒体压力测试Agilent--
        基质胶Corning--
        IHC组织芯片BioaitechR109Lu01
        组织芯片TaibsbioRLN1007

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        细胞培养
        细胞系来源（ATCC），培养条件（37°C，5% CO2，95%湿度），培养基（RPMI-1640或DMEM），血清浓度（10% FBS），抗生素（50 μg/mL青霉素-链霉素）。
        阅读提示：Materials and Methods中的Cell lines部分
        VGF操作
        VGF敲低和过表达慢病毒构建方法，shRNA序列，感染条件，筛选浓度（1-3 μg/mL嘌呤霉素）。
        阅读提示：Materials and Methods中的Virus construction and infection部分
        分子机制验证
        TLQP-21处理浓度（10 μmol/L），SB290157浓度（4 μmol/L），666-15浓度（100 nmol/L），处理时长（24小时），Co-IP和ChIP-qPCR的具体条件。
        阅读提示：Materials and Methods中的Co-immunoprecipitation analysis和Chromatin immunoprecipitation followed by qPCR部分
        代谢偶联实验
        共培养比例（SCLC:MRC-5/CAF = 5×10^5:2×10^5），AZD3965浓度（20 nmol/L），Seahorse实验条件，乳酸及乙酰辅酶A检测方法。
        阅读提示：Materials and Methods中的Coculture SCLC cells with CAFs or MRC-5 cells和Extracellular acidification rate and oxygen consumption rate measurement部分
        体内实验
        BALB/c裸鼠（4周龄，雄性），细胞注射量（NCI-H69 1×10^6，MRC-5 5×10^5），给药剂量（AZD3965 50 mg/kg，SB290157 10 mg/kg，腹腔注射），给药时长（14天）。
        阅读提示：Materials and Methods中的Animal study部分

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