验证APM对动脉粥样硬化的影响
确定APM摄入是否会加剧ApoE−/−小鼠的动脉粥样硬化。
给ApoE−/−小鼠分别喂食含0.05%、0.1%和0.15% APM的高脂高胆固醇饮食（HFCD）12周，并与对照组比较，通过油红O染色、H&E染色、天狼星红染色和免疫荧光分析评估斑块大小、脂质含量、纤维帽和炎症细胞。
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甜味剂阿斯巴甜通过胰岛素触发的炎症加重动脉粥样硬化
Sweetener aspartame aggravates atherosclerosis through insulin-triggered inflammation
实验完整度
高包含小鼠和猴模型、细胞实验（内皮细胞、单核/巨噬细胞）、遗传学操作（基因敲除）及多种功能验证（GTT、ITT、粘附、迁移等），并有多组学分析（RNA-seq、scRNA-seq）。
主要模型
ApoE−/−小鼠（高脂高胆固醇饮食诱导动脉粥样硬化模型） Cx3cr1MΦ−/−/ApoE−/−双敲除小鼠 野生型C57BL/6J小鼠（急性实验和原代细胞） 食蟹猴 原代主动脉内皮细胞（PAECs） RAW 264.7单核细胞
重点核对
APM浓度：0.15%（w/w）用于长期饮食，0.05%、0.1%、0.15%用于急性实验。 ApoE−/−小鼠喂食高脂高胆固醇饮食（HFCD）12周。 胰岛素缓释泵：植入ALZET 2004泵，释放速率0.25 μL/h，持续28天，胰岛素浓度1 mg/mL。 Cx3cr1基因敲除：Lyz2-Cre介导的单核/巨噬细胞特异性敲除。 双侧膈下迷走神经切断术（SDV）阻断APM诱导的胰岛素分泌。 胰岛素刺激PAECs 8小时（浓度0.8 μg/mL）进行RNA-seq。
摘要
食用含有人工甜味剂（ASWs）的各种食品和饮料与心血管疾病（CVDs）风险增加有关。然而，ASW相关CVD的分子机制仍不清楚。在此，我们证明摄入0.15%阿斯巴甜（APM）显著增加了小鼠和猴子的胰岛素分泌。双侧膈下迷走神经切断术（SDV）消除了APM升高的血胰岛素水平，证明了副交感神经激活在调节胰岛素分泌中的关键作用。持续给ApoE−/−小鼠喂食APM通过胰岛素依赖机制加重了动脉粥样硬化斑块的形成和生长。在ApoE−/−小鼠中植入胰岛素缓释泵加重了动脉粥样硬化。全基因组表达谱发现，在胰岛素刺激的动脉内皮细胞中，CX3CL1趋化因子是上调最显著的基因。单核细胞/巨噬细胞中特异性敲除CX3CL1受体Cx3cr1基因完全消除了APM加重的动脉粥样硬化。我们的发现揭示了APM相关动脉粥样硬化的新机制，靶向内皮CX3CL1-巨噬细胞CX3CR1信号轴为治疗动脉粥样硬化性CVD提供了一种方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人工甜味剂阿斯巴甜（APM）是否以及如何加剧动脉粥样硬化？其分子机制是什么？
- 核心机制
- APM通过激活副交感神经（迷走神经）增加胰岛素分泌，胰岛素上调内皮细胞CX3CL1表达，CX3CL1与单核/巨噬细胞上的CX3CR1相互作用，促进炎症细胞迁移、粘附和M1极化，从而加剧动脉粥样硬化斑块形成和生长。
- 主要证据
- ApoE−/−小鼠喂食APM后动脉粥样硬化斑块增加；胰岛素缓释泵模拟高胰岛素血症加剧斑块；STZ消除胰岛素逆转APM效应；RNA-seq显示Cx3cl1为胰岛素刺激的内皮细胞中最上调基因；Cx3cr1在单核/巨噬细胞中敲除后APM促进动脉粥样硬化的效应被完全消除。
- 研究意义
- 揭示了APM相关动脉粥样硬化的新机制，并确定内皮CX3CL1-巨噬细胞CX3CR1信号轴为治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测APM对胰岛素分泌的影响
验证APM摄入是否增加血液胰岛素水平，并探索其调节机制。
急性实验：小鼠经口给予APM后30分钟测定血浆胰岛素；长期实验：APM饮食12周后测定胰岛素水平；进行迷走神经切断术（SDV）以验证副交感神经的作用；同时在猴模型中验证APM对胰岛素的影响。
验证胰岛素是否足以加重动脉粥样硬化
确定外源性胰岛素升高是否能模拟APM对动脉粥样硬化的促进作用。
通过皮下植入胰岛素缓释泵（ALZET 2004）将ApoE−/−小鼠的循环胰岛素水平增加到与人类相似的水平，观察斑块形成和生长。
验证胰岛素依赖性机制
验证APM加重的动脉粥样硬化是否依赖于胰岛素信号。
使用链脲佐菌素（STZ）消除胰腺胰岛素产生，观察APM的促动脉粥样硬化作用是否被阻断。
鉴定胰岛素介导内皮炎症的关键分子
寻找胰岛素诱导动脉粥样硬化的内皮细胞关键分子。
分离原代主动脉内皮细胞（PAECs），用胰岛素刺激8小时，进行RNA-seq分析，发现CX3CL1为上调最显著的基因，并通过qPCR和Western blot验证。
验证CX3CL1-CX3CR1信号通路的功能
验证CX3CL1-CX3CR1相互作用是否介导单核/巨噬细胞的粘附、迁移和M1极化。
使用平行板流动腔（PPFC）评估单核细胞与内皮细胞的粘附；使用Boyden小室评估单核细胞迁移；检测CX3CL1刺激对巨噬细胞M1标志物表达的影响。
遗传验证CX3CR1在单核/巨噬细胞中的作用
确定在单核/巨噬细胞中特异敲除Cx3cr1是否阻断APM加重的动脉粥样硬化。
构建Cx3cr1MΦ−/−/ApoE−/−双敲除小鼠，喂食APM饮食，观察斑块形成和组分；同时进行单细胞RNA测序分析PBMC组成变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 急性APM处理 | 阿斯巴甜 | -- | -- |
| 蒸馏水 | -- | -- | |
| 长期饮食处理 | 高脂高胆固醇饮食 | Trophic Animal Feed High-Tech Co., Ltd. | -- |
| 急性APM处理 | EDTA抗凝管 | -- | -- |
| 血液化学分析 | 促凝管 | Becton Dickinson and Company | 367955 |
| 一水葡萄糖 | HUSHI | 10010518 | |
| 胰岛素（诺和灵30R） | Novo Nordisk | 8-0267-03-260-1 | |
| Mercodia小鼠胰岛素ELISA试剂盒 | Mercodia | 10-1249-01 | |
| arigo猴胰岛素ELISA试剂盒 | arigo | ARG82671 | |
| 小鼠C肽ELISA试剂盒 | RayBiotech | EIAM-CPE | |
| 猴C肽ELISA试剂盒 | NOVUS | NBP2-59957 | |
| 小鼠Fractalkine (CX3CL1) ELISA试剂盒 | ABCAM | ab100683 | |
| 油红O染色 | 油红O | Servicebio | G1015 |
| 细胞培养 | 内皮细胞专用培养基 | Procell | CM-M075 |
| 基质胶 | Coning | 356230 | |
| 细胞刺激 | 胰岛素（来自Sigma） | Sigma | I9278 |
| 天狼星红染色 | 天狼星红染色液 | Science Phygene | PH1098 |
| 免疫荧光 | 抗原修复液（P0090） | Beyotime | P0090 |
| 山羊血清（GK500710） | Gene Tech | GK500710 | |
| 抗α-SMA抗体（19245） | Cell Signaling | 19245 | |
| Alexa Fluor 594标记的山羊抗兔二抗（ZF-0516） | ZSGB-BIO | ZF-0516 | |
| 抗MOMA-2抗体（ab33451） | ABCAM | ab33451 | |
| FITC标记的山羊抗大鼠二抗（ZF-0315） | ZSGB-BIO | ZF-0315 | |
| DAPI封片剂（ab104139） | ABCAM | ab104139 | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | CWbio | 01761/40523 |
| Fastagen RNAfast200试剂盒 | Fastagen | 220011 | |
| cDNA合成 | HiScript III RT SuperMix（用于qPCR） | Vazyme | R323-01 |
| qPCR | ChamQ通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q711 |
| Light Cycler 480 | Roche | -- | |
| Western blot | 10% SDS-PAGE凝胶 | Bio-rad | 1610183 |
| PVDF膜（0.22 μm） | Millipore | ISEQ00010 | |
| 抗CX3CL1抗体（YT5354） | Immunoway | YT5354 | |
| HRP标记的山羊抗兔抗体（ZB-2301） | ZSGB-BIO | ZB-2301 | |
| M5 HiPer ECL Western HRP底物 | Mei5 Biotech | MF074-05 | |
| 抗CX3CR1抗体（ab308613） | ABCAM | ab308613 | |
| FACS | I型胶原酶 | Worthington | LS004194 |
| II型胶原酶 | Worthington | LS004174 | |
| 抗CD16/32抗体（101319） | Biolegend | 101319 | |
| APC偶联的抗小鼠CX3CL1抗体（FAB571A） | RnD system | FAB571A | |
| PE偶联的抗小鼠CD31抗体（12-0311-82） | Invitrogen | 12-0311-82 | |
| FITC偶联的抗小鼠CD45抗体（11-0451-82） | Invitrogen | 11-0451-82 | |
| CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| 迁移实验 | RAW 264.7单核细胞 | ICell Bioscience Inc | iCell-m047 |
| Transwell小室（3422） | Corning | 3422 | |
| 重组CX3CL1蛋白（50917-M08Y） | Sino Biological | 50917-M08Y | |
| 结晶紫 | KeyGEN | KGA229 | |
| 粘附实验 | 平行板流动腔（80176） | ibidi | 80176 |
| 钙黄绿素AM | Beyotime | C2012 | |
| 表达shRNA的慢病毒 | SyngenTech | -- | |
| 电镜 | 锇酸 | Ted Pella Inc | 18456 |
| Epon812树脂 | SPI | 90529-77-4 | |
| 临界点干燥仪（K850） | Quorum | K850 | |
| 离子溅射仪（MC1000） | HITACHI | MC1000 | |
| 扫描电子显微镜（SU8100） | HITACHI | SU8100 | |
| 透射电子显微镜（HT7800） | HITACHI | HT7800 | |
| 血液白细胞分离 | HISTOPAQUE分离液 | Sigma-Aldrich | 10771 |
| 红细胞裂解液 | Miltenyi | 130-094-183 | |
| 基因敲除小鼠建立 | Lyz2-Cre小鼠 | GemPharmatech | -- |
| 小鼠手术 | 脱毛膏 | Veet | 3228470 |
| 微型渗透泵（ALZET 2004） | ALZET | 2004 | |
| 细胞培养 | 磷酸盐缓冲液 | Thermo Fisher | 10010023 |
| 巨噬细胞分离 | 肉汤淀粉 | -- | -- |
| 蛋白胨 | Solarbio | P8450 | |
| 牛肉浸膏 | Solarbio | G8270 | |
| 可溶性淀粉 | Solarbio | G8300 | |
| 氯化钠 | SCR | 10019318 | |
| 血液化学分析 | Accu-Chek血糖仪 | Roche Diagnostics | -- |
| Beckman AU5821全自动生化分析仪 | Beckman | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| APM处理 | APM浓度（0.15% w/w）、处理方式（饮食或饮用水）、处理时间（12周急性30分钟） 阅读提示：请参阅STAR Methods中的'Acute and long-term treatment with APM'部分 |
| 动物模型 | 小鼠品系（ApoE−/− C57BL/6J）、年龄（6-8周）、性别（雄/雌）、饮食（高脂高胆固醇饮食）、环境条件（22°C，50-60%湿度） 阅读提示：请参阅STAR Methods中的'Mice'部分 |
| 胰岛素分泌检测 | 禁食时间（12小时）、APM给予方式（面部滴加或饮用水）、采血时间点（30分钟）、检测指标（胰岛素、C肽） 阅读提示：请参阅STAR Methods中的'Acute and long-term treatment with APM'和'Blood chemistry'部分 |
| 迷走神经切断术 | 手术方式（双侧膈下迷走神经切断术）、麻醉（戊巴比妥钠） 阅读提示：请参阅STAR Methods中的'Subdiaphragmatic vagotomy'部分 |
| 胰岛素缓释泵植入 | 泵型号（ALZET 2004）、释放速率（0.25 μL/h）、胰岛素浓度（1 mg/mL）、植入位置（皮下）、更换周期（28天） 阅读提示：请参阅STAR Methods中的'Subcutaneous insulin micropump implantation'部分 |
| 内皮细胞刺激 | 细胞类型（原代主动脉内皮细胞）、胰岛素浓度（0.8 μg/mL）、刺激时间（8小时） 阅读提示：请参阅STAR Methods中的'Endothelial cell culture and treatment'部分 |
| RNA-seq | 处理（胰岛素0.8 μg/mL 8小时）、建库试剂盒（Stranded mRNA-seq Lib Prep Kit）、测序平台（Illumina） 阅读提示：请参阅STAR Methods中的'Microarray analysis'部分 |
| 基因敲除小鼠 | Cx3cr1flox/flox小鼠、Lyz2-Cre小鼠、杂交方案 阅读提示：请参阅STAR Methods中的'Mice'部分 |
| 单细胞RNA-seq | 样本（PBMCs）、10x Genomics系统、分析软件（Cell Ranger, Seurat） 阅读提示：请参阅STAR Methods中的'Single cell-RNA sequencing'部分 |