体外共培养比较致病性
比较三种真菌对角质形成细胞的损伤和炎症反应差异
将HaCaT细胞与三种真菌活孢子共培养24小时，检测LDH释放、细胞活性、IL-1β等细胞因子产生和菌落形成单位。
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双重RNA测序与液相色谱-质谱联用揭示须癣毛癣菌复合体致病性的特异性见解
Dual RNA-Sequencing and Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Unveil Specific Insights on the Pathogenicity of Trichophyton mentagrophytes Complex
实验完整度
高涵盖体外细胞实验、双RNA-seq、LC-MS、体内小鼠模型、体外皮肤模型及人皮肤样本，并进行功能与机制验证。
主要模型
HaCaT细胞系 C57小鼠浅表和深部皮肤癣菌病模型 体外重建人表皮模型(EpiKutis) 患者皮损样本
重点核对
真菌菌株：须癣毛癣菌BMU04948、趾间毛癣菌BMU08191、断发毛癣菌BMU02128 细胞模型：HaCaT角质形成细胞，2.5×10^5细胞/ml与2.5×10^5/ml活孢子共培养24小时 SN-38浓度梯度：40、200、4、40、400 ng/ml处理24小时 动物模型：浅表感染2×10^8/ml（150 μl）涂抹背部3天；深部感染4×10^8/ml（50 μl）足垫注射3天 抑制剂处理：Syk抑制剂R406(5 μM/ml)、MyD88抑制剂Resatorvid(1 nM/ml)、TLR2抑制剂C29(1 μM/ml)预处理2小时
摘要
须癣毛癣菌越来越被认为是公共卫生危害，因为它引起最严重的皮肤癣菌病表现。在本研究中，我们进行了一系列研究以确定须癣毛癣菌复合体的致病性。我们发现须癣毛癣菌复合体通过模式识别受体-MAPK/非经典NF-κB通路与角质形成细胞相互作用，且须癣毛癣菌的菌丝形态是角质形成细胞炎症反应增强的原因。此外，SN-38可能是须癣毛癣菌的一种毒素，在体内和体外均可诱导角质形成细胞凋亡。我们的结果解释了临床上观察到的须癣毛癣菌的严重致病性和破坏性，并为设计新型毒素靶向疗法以改善患者预后铺平了道路。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 须癣毛癣菌复合体不同物种对宿主角质形成细胞的致病性差异及其机制是什么？
- 核心机制
- 须癣毛癣菌复合体通过PRR-MAPK/非经典NF-κB通路激活角质形成细胞炎症反应；须癣毛癣菌的菌丝形态诱导强烈炎症，其分泌的SN-38毒素诱导角质形成细胞凋亡。
- 主要证据
- 体外共培养显示须癣毛癣菌引起更高LDH释放、IL-1β等炎症因子表达；双RNA-seq揭示其激活更广泛的趋化因子和细胞因子；蛋白水平验证MAPK和非经典NF-κB通路激活；LC-MS检测到SN-38显著升高，体外和体内实验证实SN-38诱导凋亡。
- 研究意义
- 解释了须癣毛癣菌临床高致病性和破坏性，为设计新型毒素靶向疗法改善患者预后奠定基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
双RNA-seq分析宿主与真菌转录组
全局分析角质形成细胞对三种真菌的应答及真菌的致病基因
共培养24小时后提取RNA，进行双RNA测序，分析宿主DEGs和真菌DEGs，并进行GO和KEGG富集分析。
信号通路蛋白验证与抑制剂研究
验证PRR-MAPK/非经典NF-κB通路在真菌识别中的作用
免疫印迹检测MAPK和NF-κB通路蛋白磷酸化；使用Syk、MyD88、TLR2抑制剂预处理后检测CXCL8转录水平。
真菌形态与炎症反应关系
确定真菌的菌丝、孢子或分泌因子哪一种主要诱导炎症
分别用真菌培养上清、菌丝、孢子或组合刺激角质形成细胞4小时，检测IL-6、CXCL1、CXCL8表达。
细胞死亡方式检测
评估真菌诱导的角质形成细胞凋亡、焦亡和坏死
用活孢子或上清刺激细胞，流式检测Annexin V/7AAD、cleaved caspase-3和caspase-1，并检测LDH释放。
LC-MS分析分泌代谢物并鉴定SN-38
筛选须癣毛癣菌上清中潜在毒力因子
收集三菌上清进行LC-MS分析，比较代谢物差异，发现SN-38显著升高，并通过标准曲线定量。
SN-38体外功能验证
验证SN-38对角质形成细胞凋亡的作用
用不同浓度SN-38处理角质形成细胞24小时，检测凋亡、caspase-3激活、LDH释放、IL-6表达和caspase-1激活。
体内小鼠模型验证
在体内验证真菌致病性和SN-38诱导凋亡
建立浅表和深部皮肤癣菌病小鼠模型，评估临床表现、组织病理、真菌载量、炎症因子和免疫细胞浸润；并单独给予SN-38观察凋亡。
体外皮肤模型与人皮肤验证
在更接近人体的模型中验证致病性和凋亡
使用重建人表皮模型感染10000孢子/孔，2天后检测PAS和caspase-3；对患者皮损进行caspase-3 IHC。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 细胞毒性检测 | LDH细胞毒性检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| RNA-seq | TruSeq RNA样品制备试剂盒 | Illumina | -- |
| RT-qPCR | Power SYBR Green PCR预混液 | Applied Biosystems | -- |
| ELISA | ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Cell Signaling Technology | -- |
| BCA蛋白定量试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 增强化学发光试剂 | Thermo Scientific Pierce | -- | |
| 免疫印迹抗体 | 磷酸化ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4370S |
| 磷酸化JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 4668S | |
| 磷酸化p38抗体 | Cell Signaling Technology | 9211S | |
| 磷酸化NF-κB p65抗体 | Cell Signaling Technology | 3033T | |
| 磷酸化relB抗体 | Cell Signaling Technology | 4999 | |
| 磷酸化GSK抗体 | Cell Signaling Technology | 9323T | |
| 磷酸化Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 4060T | |
| ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4695S | |
| JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 9252S | |
| p38抗体 | Cell Signaling Technology | 9218 | |
| NF-κB p65抗体 | Cell Signaling Technology | 8242T | |
| relB抗体 | Cell Signaling Technology | 10544 | |
| GSK抗体 | Cell Signaling Technology | 9315S | |
| Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 4691T | |
| 抑制剂处理 | R406 | Selleck Chemicals | -- |
| Resatorvid | Selleck Chemicals | -- | |
| C29 | Selleck Chemicals | -- | |
| 流式凋亡检测 | Annexin V-FITC/7AAD染色 | ProCell Therapeutics | -- |
| cleaved caspase-1抗体 | ImmunoWay Biotechnology | YC0002 | |
| cleaved caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661T | |
| LC-MS | 超高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Orbitrap Q Exactive HF-X质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱 | Waters | -- | |
| SN-38定量 | SN-38标准品 | Selleck Chemicals | S4908 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Servicebio | -- |
| 流式免疫分型 | 抗小鼠抗体（CD45, CD3, CD4, IL-17, CD25, FOXP3） | BioLegend | -- |
| 免疫组化 | Caspase-3抗体 | Abcam | -- |
| 髓过氧化物酶抗体 | Abcam | -- | |
| F4/80抗体 | Abcam | -- | |
| 体外皮肤模型 | EpiKutis | Biocell Biotechnology | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 真菌培养 | 菌株编号、培养时间（14天）、温度（28℃）、培养基（SDA） 阅读提示：Supplementary Materials and Methods: Fungal strains preparation |
| 细胞培养 | 细胞系（HaCaT）、培养基（DMEM+10%FBS+双抗）、培养条件（37℃、5% CO2） 阅读提示：Supplementary Materials and Methods: Keratinocyte cell line |
| 共培养实验 | 细胞密度（2.5×10^5 cells/ml）、孢子浓度（2.5×10^5/ml）、共培养时间（24小时）、温度（37℃） 阅读提示：Supplementary Materials and Methods: Coculture assay and conditions |
| LDH检测 | 试剂盒品牌（Beyotime）、检测波长（490 nm） 阅读提示：Supplementary Materials and Methods: Measurement of lactate dehydrogenase activity |
| RNA-seq | 建库试剂盒（TruSeq）、测序平台（HiSeq X Ten/Novaseq 6000）、生物重复数（3）、DEGs阈值（|log2FC|>1, Q≤0.05） 阅读提示：Supplementary Materials and Methods: RNA extraction...; Differential expression analysis... |
| 抑制剂处理 | 抑制剂种类、浓度（R406 5 μM/ml, Resatorvid 1 nM/ml, C29 1 μM/ml）、预处理时间（2小时）、刺激时间（24小时） 阅读提示：Supplementary Materials and Methods: Inhibitor treatments |
| 凋亡检测 | 刺激时间（6小时）、染色试剂（Annexin V/7AAD）、检测方法（流式） 阅读提示：Supplementary Materials and Methods: Flow cytometric assessment of apoptosis and pyroptosis |
| LC-MS | 上清收集时间（24小时）、过滤（0.22 μm）、液相色谱柱（ACQUITY UPLC HSS T3）、质谱仪（Q Exactive HF-X） 阅读提示：Supplementary Materials and Methods: Liquid chromatography–mass spectrometry analyses |
| SN-38定量 | 标准品（S4908）、内标（nilotinib）、样品处理（200 μl上清+20 μl内标+600 μl乙腈） 阅读提示：Supplementary Materials and Methods: Identification and quantification of SN-38 |
| SN-38体外实验 | 浓度（40,200,4,40,400 ng/ml）、处理时间（24小时） 阅读提示：Supplementary Materials and Methods: In vitro functional study of SN-38 |
| 小鼠模型 | 小鼠品系（C57，6-8周龄）、感染剂量（浅表2×10^8/ml,150μl；深部4×10^8/ml,50μl）、观察时间（3天） 阅读提示：Supplementary Materials and Methods: Murine model of superficial and deep dermatophytosis |
| 体外皮肤模型 | 皮肤模型（EpiKutis）、接种密度（10000孢子/孔）、感染时间（2天） 阅读提示：Supplementary Materials and Methods: In vitro skin model of dermatophytosis |