筛选有效菌株
筛选出能显著降低LPS诱导的促炎因子水平的HK-LP菌株。
用7种HK-LP（1 μg/mL）处理LPS（100 μg/mL）诱导的Caco-2细胞单层24小时，通过ELISA检测TNF-α、IL-1β、IL-6水平。
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热灭活副干酪乳杆菌通过MLCK/MLC通路激活修复脂多糖诱导的肠上皮屏障损伤
Heat-Killed Lacticaseibacillus paracasei Repairs Lipopolysaccharide-Induced Intestinal Epithelial Barrier Damage via MLCK/MLC Pathway Activation
实验完整度
中包含细胞活力、屏障功能、炎症因子、TJ蛋白、通路蛋白检测等多层级体外实验，但缺乏动物或体内验证。
主要模型
Caco-2细胞单层模型 LPS诱导的Caco-2肠上皮屏障损伤模型
重点核对
LPS浓度：100 μg/mL HK-LP浓度：1 μg/mL HK-LP培养时间：18 h和48 h 处理时间：24 h Caco-2细胞分化时间：21天
摘要
肠上皮屏障功能与许多肠道疾病的发生发展密切相关。热灭活副干酪乳杆菌（HK-LP）已被证明能够改善肠道健康并增强免疫力。然而，HK-LP在肠道屏障中的功能仍不清楚。本研究使用脂多糖（LPS）（100 μg/mL）诱导的Caco-2细胞，表征了七种HK-LP（1 μg/mL）对肠道屏障的炎症效应。在本研究中，筛选了HK-LP 6105、6115和6235，并比较了它们对炎症因子和紧密连接蛋白表达（claudin-1、zonula occludens-1和occludin）的调节作用。研究了不同培养时间（18和48小时）对LPS诱导的肠上皮屏障功能障碍的影响。我们的结果表明，HK-LP 6105、6115和6235改善了LPS诱导的肠道屏障通透性降低和跨上皮电阻。此外，HK-LP 6105、6115和6235抑制了促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）并增加了抗炎因子（IL-4、IL-10和TGF-β）的表达。HK-LP 6105、6115和6235改善了炎症反应。它通过下调Toll样受体4（TLR4）/NF-κB通路，抑制了核因子κB（NF-κB）信号通路介导的肌球蛋白轻链（MLC）/MLC激酶信号通路。因此，结果表明HK-LP 6105、6115和6235可能通过调节炎症和TJ蛋白来改善肠道健康。这些菌株产生的后生元具有抗炎特性，可以保护肠道屏障。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 热灭活副干酪乳杆菌（HK-LP）能否修复LPS诱导的肠上皮屏障损伤，其机制是否涉及MLCK/MLC通路？
- 核心机制
- HK-LP通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，下调MLCK/MLC通路，减少MLC磷酸化，从而保护紧密连接蛋白并修复肠屏障功能。
- 主要证据
- 在LPS诱导的Caco-2细胞单层模型中，HK-LP 6105、6115和6235提高了TEER值，降低了FITC-dextran通透性，抑制促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6），增加抗炎因子（IL-4、IL-10、TGF-β），并恢复紧密连接蛋白（ZO-1、claudin-1、occludin）的表达。Western blot显示HK-LP降低TLR4、MyD88、p-NF-κB、MLCK和p-MLC水平。
- 研究意义
- HK-LP有潜力作为膳食补充剂用于预防或延缓肠道疾病的进展，其抗炎和屏障保护特性可能有利于肠道健康。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞活力检测
确定HK-LP对Caco-2细胞活力的影响，排除细胞毒性浓度。
使用CCK8试剂盒检测不同浓度（0.01-100 μg/mL）和不同处理时间（6、24、48、72小时）下HK-LP对Caco-2细胞活力的影响。
评估屏障功能
评估LPS诱导的屏障损伤及HK-LP的修复效果。
使用TEER和FITC-dextran渗透实验检测Caco-2细胞单层的屏障完整性。
检测炎症因子表达
验证HK-LP对LPS诱导的炎症反应的调节作用。
通过RT-qPCR检测促炎因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）和抗炎因子（IL-4、IL-10、TGF-β）的mRNA表达水平。
检测紧密连接蛋白表达
验证HK-LP对LPS诱导的紧密连接蛋白表达下降的恢复作用。
通过RT-qPCR和Western blot检测ZO-1、claudin-1、occludin的mRNA和蛋白表达，并通过免疫荧光观察ZO-1分布。
检测TLR表达
探究HK-LP对LPS诱导的TLR表达的影响。
通过RT-qPCR检测TLR2、TLR3、TLR5、TLR7的mRNA表达。
检测TLR4/NF-κB通路
验证HK-LP是否通过TLR4/NF-κB通路发挥抗炎作用。
通过Western blot检测TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB蛋白表达，以及免疫荧光观察NF-κB核转位。
检测MLCK/MLC通路
验证HK-LP是否通过抑制MLCK/MLC通路来保护屏障功能。
通过Western blot检测MLCK、p-MLC、MLC蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
细胞培养与模型建立
细胞活力检测
屏障功能评估
基因表达分析
蛋白表达分析
蛋白定位分析
炎症因子检测
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Caco-2人结肠癌细胞系 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | -- |
| 刺激物 | 脂多糖 | Sigma | -- |
| 通透性检测 | FITC-葡聚糖（4 kDa） | Sigma | -- |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | VivaCell Bioscience | -- |
| DMEM培养基 | VivaCell Bioscience | -- | |
| 青霉素-链霉素 | VivaCell Bioscience | -- | |
| 胰蛋白酶EDTA | VivaCell Bioscience | -- | |
| Hanks平衡盐溶液 | VivaCell Bioscience | -- | |
| 磷酸盐缓冲液 | VivaCell Bioscience | -- | |
| Western blot | β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | 66009-1-lg |
| MyD88抗体 | Proteintech | 23230-1-AP | |
| TLR4抗体 | Proteintech | 19811-1-AP | |
| Claudin-1抗体 | Proteintech | 13050-1-AP | |
| Occludin抗体 | Proteintech | 27260-1-AP | |
| ZO-1抗体 | Proteintech | 21773-1-AP | |
| NF-κB p65抗体 | Proteintech | 10745-1-AP | |
| MLCK抗体 | Proteintech | 21642-1-AP | |
| MLC抗体 | Proteintech | 10906-1-AP | |
| HRP标记亲和纯化山羊抗小鼠IgG | Proteintech | SA00001-1 | |
| HRP标记亲和纯化山羊抗兔IgG | Proteintech | SA00001-2 | |
| 免疫荧光 | CoraLite488标记亲和纯化山羊抗兔IgG | Proteintech | SA00013-2 |
| CoraLite594标记亲和纯化山羊抗兔IgG | Proteintech | SA00013-4 | |
| Western blot | p-MLC (Thr18/Ser19)抗体 | Cell Signaling Technology | 3674 |
| 磷酸化p65 (Ser536)抗体 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| 细菌培养 | MRS肉汤 | AoBox | -- |
| 细胞培养 | 12孔Transwell板 | Corning | -- |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Abcam | -- |
| TEER检测 | Millicell ERS伏特计 | Millipore | -- |
| 荧光检测 | 多功能酶标仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RT-qPCR | ABI Prism 7300实时荧光定量PCR系统 | ABI | -- |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | Solarbio | -- |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 免疫荧光 | 荧光显微镜 | Leica | -- |
| 统计分析 | SPSS软件 | IBM | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 菌株培养与热处理 | HK-LP培养时间：18 h和48 h；热处理条件：100 °C 30 min 阅读提示：参见 Section 2.2 |
| 细胞培养与分化 | Caco-2细胞密度：1 × 10^4 cells/cm2；分化时间：21天 阅读提示：参见 Section 2.3 |
| LPS诱导与HK-LP处理 | LPS浓度：100 μg/mL；HK-LP浓度：1 μg/mL；处理时间：24 h 阅读提示：参见 Sections 2.5, 2.6, 2.7 |
| 屏障功能检测 | TEER值需超过300 Ω/cm2；FITC-dextran分子量：4 kDa；荧光检测波长：490/520 nm 阅读提示：参见 Sections 2.5, 2.6 |
| 炎症因子检测 | ELISA试剂盒：Proteintech；检测时间：处理24 h后 阅读提示：参见 Section 2.7 |
| 基因表达检测 | 内参基因：GAPDH；数据分析方法：2^-ΔΔCt 阅读提示：参见 Section 2.8 |
| Western blot | 抗体稀释比例：一抗1:1000，二抗1:4000；封闭液：5% BSA 阅读提示：参见 Section 2.9 |
| 免疫荧光 | 固定液：4% 多聚甲醛；透化：0.5% Triton X-100；封闭：2% BSA；一抗：抗ZO-1和NF-κB p65；二抗：CoraLite488荧光二抗1:500；核染色：DAPI 阅读提示：参见 Section 2.10 |