临床样本中THBS1表达分析
验证THBS1在OSF组织中的表达模式及与正常组织的差异。
对10例有槟榔咀嚼史患者的OSF组织和相邻正常黏膜（ANM）进行免疫荧光（IF）染色，分析THBS1与上皮标志物pan-CK的共定位及基质中THBS1的表达水平。
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基质血小板反应蛋白1抑制口腔黏膜下纤维化中的血管生成
Stromal thrombospondin 1 suppresses angiogenesis in oral submucous fibrosis
实验完整度
高包含临床样本表达验证、体外类器官模型、细胞功能实验及动物模型等多层级证据，并进行了功能获得与缺失及机制验证。
主要模型
口腔黏膜组织来源的类器官与成纤维细胞附着类器官（FAO） 血管化成纤维细胞附着类器官（vFAO） 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）与成纤维细胞共培养模型 槟榔碱诱导的大鼠OSF模型
重点核对
临床样本中THBS1在OSF基质中的表达上调（图1a、b，n=10） FAO模型中，槟榔碱（10 μg/mL）处理后TGF-β1分泌增加及THBS1表达上调，P144（100 μg/mL）可阻断 成纤维细胞中THBS1敲低或过表达对HUVEC出芽的影响（图3、4） vFAO模型中，抗CD36抗体可减弱槟榔碱诱导的CD31表达降低 大鼠OSF模型中，THBS1抑制剂LSKL与对照肽SLLK（各2 mg/mL）处理对胶原沉积和血管密度的影响
摘要
黏膜血管减少是口腔黏膜下纤维化（OSF）的组织学标志，OSF是一种主要由槟榔咀嚼引起的癌前疾病。然而，缺乏可用模型对OSF中的血管生成研究提出了挑战。在这里，我们发现内源性血管生成抑制蛋白——血小板反应蛋白1（THBS1）在OSF组织的基质中表达升高。利用成纤维细胞附着类器官（FAO）模型，OSF中THBS1的过表达在体外稳定重现。在FAO模型中，槟榔碱（槟榔中的主要致病成分）处理增强了上皮细胞分泌转化生长因子（TGF）-β1，进而促进成纤维细胞中THBS1的表达。此外，将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）整合到FAO中，以模拟血管化成分。成纤维细胞中THBS1过表达显著抑制了血管化FAOs（vFAOs）中内皮细胞的出芽能力。一致地，槟榔碱处理降低了vFAOs中CD31的表达，而当内皮细胞预先与THBS1受体CD36的中和抗体孵育时，这种效应减弱。最后，在槟榔碱诱导的大鼠OSF模型中，抑制THBS1可减轻体内胶原沉积和血管减少。总体而言，我们利用组装类器官模型研究OSF发病机制，并为靶向THBS1提供了依据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 基质细胞中的THBS1是否通过CD36依赖的方式调节OSF中的血管生成，并作为潜在的治疗靶点。
- 核心机制
- 槟榔碱刺激上皮细胞分泌TGF-β1，TGF-β1通过p-Smad3信号促进成纤维细胞表达THBS1，后者与内皮细胞上的CD36受体结合，抑制内皮细胞出芽和血管生成。
- 主要证据
- 临床样本显示THBS1在OSF基质中过表达；FAO模型中，TGF-β1诱导THBS1表达，且槟榔碱处理通过TGF-β1依赖方式上调THBS1；在成纤维细胞-HUVEC共培养及vFAO模型中，THBS1敲低促进而过表达抑制内皮细胞出芽；抗CD36抗体可逆转其抑制作用；大鼠OSF模型中，THBS1抑制剂LSKL减轻胶原沉积并恢复CD31表达。
- 研究意义
- 该研究提供了THBS1作为OSF治疗靶点的依据，并展示了组装类器官模型在OSF发病机制研究中的价值。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建FAO模型并验证THBS1表达
建立可稳定重现OSF基质THBS1过表达的体外模型。
从OSF和ANM组织分离上皮细胞和成纤维细胞，制备FAO。通过IF和免疫印迹（IB）检测THBS1在FAO中的表达，并利用高内涵成像分析验证细胞共培养。
槟榔碱和TGF-β1对THBS1表达的调控
探究槟榔碱是否通过TGF-β1信号通路促进成纤维细胞中THBS1的表达。
用不同浓度槟榔碱处理上皮类器官和成纤维细胞，ELISA检测上清中TGF-β1。用槟榔碱处理的类器官条件培养基（ATO-CM）处理成纤维细胞，检测THBS1和α-SMA表达。使用TGF-β1受体拮抗剂P144验证其依赖性。在FAO中通过IF检测THBS1表达。
成纤维细胞THBS1对内皮细胞功能的影响
验证成纤维细胞来源的THBS1是否抑制内皮细胞出芽，并检查其CD36依赖性。
在OSF成纤维细胞中敲低THBS1，在正常成纤维细胞中过表达THBS1，构建成纤维细胞-HUVEC共培养模型，观察HUVEC出芽。用重组人THBS1或成纤维细胞条件培养基处理HUVEC，进行胶内出芽和管形成实验，并加抗CD36抗体验证。检测caspase-3表达。
vFAO模型中槟榔碱和THBS1对内皮细胞标志物的影响
在更接近体内微环境的模型中验证槟榔碱通过THBS1/CD36轴影响内皮细胞。
将HUVECs整合到FAO中形成vFAO，并观察THBS1敲低或过表达对HUVEC出芽和成纤维细胞形态的影响。在vFAO中用槟榔碱处理，检测CD31表达，并用P144和抗CD36抗体处理验证信号通路。
大鼠OSF模型中THBS1抑制效果评估
验证抑制THBS1能否减轻OSF症状和胶原沉积并恢复血管化。
建立槟榔碱诱导的大鼠OSF模型（28只SD大鼠，分4组），其中两组注射槟榔碱，另两组在建模后分别注射THBS1抑制剂LSKL或对照肽SLLK。观察口腔病变、测量张口度，12周后处死取材，进行Masson染色和IF检测胶原、THBS1和CD31。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 类器官培养 | Advanced DMEM/F12培养基 | Gibco | C12571500BT |
| N2补充剂 | Stemcell technology | 07152 | |
| B27补充剂 | Stemcell technology | 7511 | |
| Y-27632 | MCE | HY-10071 | |
| A83-01 | MCE | HY-10432 | |
| 毛喉素 | MCE | HY-15371 | |
| 表皮生长因子 | R&D | 236-EG-200 | |
| 头蛋白 | R&D system | 6057 | |
| R-spondin | R&D system | 4645 | |
| Wnt3A | R&D system | 5036 | |
| 成纤维细胞培养 | 胰蛋白酶-EDTA溶液（0.25%） | Gibco | 25200-056 |
| MEM α培养基 | Gibco | C12571500BT | |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Gibco | 10099141 |
| 内皮细胞培养 | 内皮细胞培养基 | Sciencell | 1001 |
| FAO构建 | 基质胶 | Corning | 356237 |
| FAO培养 | 头蛋白 | R&D system | 6057 |
| R-spondin | R&D system | 4645 | |
| vFAO培养 | EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 |
| 免疫荧光 | THBS1抗体 | Abcam | ab1823 |
| CD31抗体 | CST | 3528 | |
| Collagen III抗体 | Abcam | ab184993 | |
| Pan-Keratin抗体 | CST | 4545 | |
| COL1A1抗体 | CST | 72026 | |
| COL3A1抗体 | CST | 66887 | |
| 免疫印迹 | THBS1抗体 | Proteintech | 18204-1-AP |
| Pan-Keratin抗体 | CST | 4545S | |
| Smad2抗体 | CST | 5339 | |
| Phospho-Smad2抗体 | CST | 3108 | |
| Smad3抗体 | CST | 9523 | |
| Phospho-Smad3抗体 | CST | 9520 | |
| α-SMA抗体 | CST | 19245S | |
| Caspase-3抗体 | Abcam | ab32042 | |
| 染色质免疫沉淀 | ChIP试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Masson染色 | Masson染色试剂盒 | Servicebio | G1006 |
| ELISA | 人TGF-β1 ELISA试剂盒 | Neo Bioscience Technology | EHC107b.96 |
| 人THBS1/TSP1 ELISA试剂盒 | Raybiotech | EK0899 | |
| 动物实验 | 槟榔碱 | Selleck | S2614 |
| LSKL | MCE | HY-P0299 | |
| SLLK | MCE | HY-P0301 | |
| 二甲基亚砜 | Applichem | A3672 | |
| 细胞培养 | 人脐静脉内皮细胞 | Sciencell | DFSC-EC-01 |
| 高内涵成像 | Opera PhenixTM 高内涵筛选系统 | PerkinElmer | -- |
| 成像分析 | Harmony软件v.4.9 | PerkinElmer | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本收集 | 样本来源：OSF及相邻正常黏膜组织，来自有槟榔咀嚼史的口腔癌患者（n=10）；病理诊断标准；伦理批件号 阅读提示：Materials and methods: Collection of clinical samples |
| 类器官和成纤维细胞培养 | 培养基组成：Advanced DMEM/F12 + N2 + B27 + Y-27632 + A83-01 + forskolin + EGF；传代补充：Noggin、R-spondin、Wnt3A；组织消化：0.25%胰蛋白酶-EDTA 30分钟；成纤维细胞培养基：MEM ALPHA + 10% FBS 阅读提示：Materials and methods: Organoid culture, Fibroblasts and endothelial cells culture |
| FAO和vFAO构建 | 细胞数量比例：FAO为105上皮细胞和3×105成纤维细胞；vFAO为105上皮细胞、3×105成纤维细胞和105 HUVEC；细胞团在超低吸附板培养24-48小时；包埋于Matrigel；vFAO培养基补充33.3% MEM ALPHA和33.3% EGM-2 BulletKit 阅读提示：Materials and methods: Construction of Fibroblast-attached Organoid (FAO), Generation of vascularized FAO (v-FAO) |
| 槟榔碱和抑制剂处理 | 槟榔碱处理浓度：10 μg/mL（部分实验1-100 μg/mL）；P144浓度：100 μg/mL；抗CD36抗体预孵育；LSKL和SLLK浓度：2 mg/mL，每次100 μL，每周2次 阅读提示：Results sections: Arecoline promotes the expression of stromal THBS1 in FAOs, Arecoline reduces the expression of endothelial marker in vascularized FAOs; Materials and methods: Animal experiments |
| 动物实验 | 动物品系：雌性SD大鼠（28只）；分组：4组（A为DMSO对照，B为槟榔碱，C为槟榔碱+SLLK，D为槟榔碱+LSKL）；给药方式：右侧颊黏膜下注射；注射量：100 μL，每周2次；实验周期：12周 阅读提示：Materials and methods: Animal experiments |
| 检测方法 | IF染色：THBS1、CD31、pan-CK等抗体；IB：THBS1、α-SMA、caspase-3等；ELISA：TGF-β1、THBS1分泌量；ChIP：p-Smad3结合THBS1启动子；Masson染色评估胶原 阅读提示：Materials and methods: Immunofluorescence assay, Immunoblotting assay, Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, Masson staining, Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), Tube formation assay |