临床样本分析
评估FAPα在结直肠癌原发和转移组织中的表达差异
使用免疫荧光和FISH检测EpCAM+肿瘤细胞中FAPα蛋白和基因表达，比较原发肿瘤、淋巴结转移和肝转移组织。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
靶向FAPα阳性淋巴结转移性肿瘤细胞抑制结直肠癌转移
Targeting FAP α-positive lymph node metastatic tumor cells suppresses colorectal cancer metastasis
实验完整度
高包含临床样本分析、体外细胞功能实验、体内动物模型（患者来源异种移植和同种异体移植）以及药物干预，涵盖机制验证和功能验证。
主要模型
SW480和SW620结直肠癌细胞系 患者来源的原代结直肠癌细胞（P-CRC和LNM-CRC） HCT116结直肠癌细胞系 BALB/c裸鼠和C57BL/6小鼠的结直肠癌淋巴结转移异种移植模型
重点核对
FAPα在淋巴结转移组织中的高表达（通过免疫荧光和FISH验证） FAPα通过STAT3通路促进肿瘤细胞迁移、侵袭、EMT和干性（通过体外功能实验和STAT3抑制剂CTS验证） FAPα通过VEGFC促进淋巴管生成（通过ELISA和hLEC管形成实验验证） Z-GP-DAVLBH在体内抑制CRCLNM（通过患者来源异种移植模型验证）
摘要
淋巴转移是结直肠癌的主要转移途径，它增加了癌症复发和远处转移的风险。淋巴结转移性结直肠癌（LNM-CRC）细胞的特性尚不清楚，且缺乏有效的治疗方法。在这里，我们发现缺氧诱导了LNM-CRC细胞中成纤维细胞激活蛋白α（FAPα）的表达。功能获得或丧失实验表明，FAPα通过激活STAT3通路增强了肿瘤细胞的迁移、侵袭、上皮-间质转化、干性和淋巴管生成。此外，肿瘤细胞中的FAPα诱导了细胞外基质重塑，并通过招募调节性T细胞建立了免疫抑制环境，从而促进结直肠癌淋巴结转移（CRCLNM）。Z-GP-DAVLBH，一种FAPα激活的前药，通过靶向FAPα阳性的LNM-CRC细胞抑制了CRCLNM。我们的研究强调了FAPα在肿瘤细胞中对CRCLNM的作用，并为CRCLNM提供了潜在的治疗靶点和有前景的策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 淋巴结转移性结直肠癌细胞中FAPα的表达及其在结直肠癌淋巴结转移中的作用和潜在治疗策略。
- 核心机制
- 缺氧通过HIF-1α通路诱导肿瘤细胞FAPα表达，FAPα激活STAT3信号通路，促进肿瘤细胞迁移、侵袭、EMT、干性、淋巴管生成、ECM重塑和免疫抑制，从而促进CRCLNM。
- 主要证据
- 临床样本显示FAPα在淋巴结转移肿瘤细胞中高表达；体外实验显示FAPα过表达促进SW480细胞迁移、侵袭、EMT和干性，并增强hLEC增殖和管形成；体内实验显示FAPα过表达增加小鼠模型中LN转移灶数量。
- 研究意义
- 本研究揭示了FAPα在肿瘤细胞中促进CRCLNM的作用，为CRCLNM提供了潜在的治疗靶点和策略，即通过FAPα激活前药Z-GP-DAVLBH靶向FAPα阳性淋巴结转移肿瘤细胞。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外细胞功能实验
验证FAPα对肿瘤细胞迁移、侵袭、EMT、干性和淋巴管生成的影响及其机制
使用SW480和SW620细胞系，通过过表达或敲低FAPα，检测细胞迁移、侵袭、EMT标记物、干性标记物及hLEC增殖和管形成。
体内动物模型验证
评估FAPα在体内对结直肠癌淋巴结转移的影响
构建患者来源异种移植模型和同种异体移植模型，过表达或敲低FAPα，检测淋巴结转移灶数量、EMT和干性标记物、淋巴管生成。
ECM重塑和免疫抑制分析
探究FAPα是否通过ECM重塑和免疫抑制促进转移
使用Masson和Sirius Red染色检测胶原沉积，免疫荧光检测胶原I排列，流式细胞术检测Treg细胞。
药物干预实验
评估Z-GP-DAVLBH对LNM-CRC细胞和CRCLNM的抑制作用
体外检测Z-GP-DAVLBH对LNM-CRC细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭、EMT和干性的影响；体内评估其对患者来源异种移植模型的肿瘤生长和淋巴结转移的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | ExCell Bio | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 内皮细胞培养基 | ScienCell | 1001 | |
| 缺氧实验 | 模块化培养箱 | Billups-Rothenberg | -- |
| 组织消化 | 肿瘤组织解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-108-339 |
| GentleMACS组织处理器 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 细胞分选 | 抗CD326磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-061-101 |
| 流式分析 | 抗EpCAM抗体 | Biolegend | 369809 |
| 抗CK19抗体 | R&D | AF3506 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000150 |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | Gibco | A1113803 |
| Western blot | RIPA裂解液 | Servicebio | G2002 |
| Pierce BCA蛋白测定试剂盒 | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pierce ECL Western印迹底物 | Thermo Scientific | 23132 | |
| RT-qPCR | E.Z.N.A.总RNA提取试剂盒I | Omega Bio-Tek | R6834 |
| All-in-One cDNA合成SuperMix | Genestar | A233 | |
| 2× SYBR Green qPCR预混液 | Genestar | A301 | |
| LightCycler 480系统 | Roche | -- | |
| 细胞增殖 | 细胞计数试剂盒-8 | Targetmol | C0005 |
| EdU细胞增殖试剂盒 | Beyotime | C0075 | |
| 细胞划痕 | 培养插入件 | ibidi | 80369 |
| 管形成 | 基质胶 | Corning | 356234 |
| 凋亡检测 | 碘化丙啶 | Beyotime | ST512 |
| 迁移侵袭 | Transwell小室 | Corning | 3422 |
| 结晶紫 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 成球实验 | PKH67绿色荧光细胞连接试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- |
| DMEM-F12培养基 | VivaCell | -- | |
| 表皮生长因子 | PeproTech | 100-47 | |
| 成纤维细胞生长因子 | PeproTech | 100-18B | |
| B-27无血清补充物 | Gibco | 17504-044 | |
| ELISA | VEGFC ELISA试剂盒 | Liankebio | -- |
| CCL17和CCL22 ELISA试剂盒 | Neobioscience | -- | |
| ChIP-qPCR | SimpleChIP酶学染色质IP试剂盒 | Cell Signaling Technology | 9002S |
| 流式分析 | IV型胶原酶 | Servicebio | -- |
| 透明质酸酶 | Servicebio | -- | |
| 小鼠调节性T细胞染色试剂盒 | Liankebio | -- | |
| FACS Canto II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | -- |
| 组织染色 | DAB染色试剂盒 | Servicebio | G1212 |
| Masson三色染色试剂盒 | Solarbio | G1343 | |
| 天狼星红染色试剂盒 | Servicebio | GB1018 | |
| 免疫荧光 | TSAPLus荧光试剂盒 | Servicebio | G1236 |
| Alexa Fluor 488偶联二抗 | Invitrogen | -- | |
| Alexa Fluor 594-鬼笔环肽 | Thermo Scientific | A12381 | |
| 显微镜 | Olympus BX53倒置荧光显微镜 | Olympus | -- |
| Zeiss LSM 800共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| Axio Observer倒置荧光显微镜 | Zeiss | -- | |
| 小动物成像 | IVIS Lumina LT成像系统 | PerkinElmer | -- |
| D-荧光素 | Yeasen | -- | |
| 动物实验 | 磷酸盐缓冲液 | HyClone | -- |
| 生理盐水 | Servicebio | -- | |
| 药物处理 | Z-GP-DAVLBH | 文中未明确说明 | -- |
| 隐丹参酮 | 文中未明确说明 | -- | |
| SAR131675 | 文中未明确说明 | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源：SW480、SW620、HCT116、HT-29、LoVo、DLD1、MC38；培养基、血清浓度、抗生素浓度；缺氧条件（1% O2, 5% CO2, 94% N2） 阅读提示：Section 2.2 Cell lines and cell culture |
| 体外功能实验 | FAPα过表达和敲低的构建方法（质粒、siRNA）；迁移/侵袭实验的细胞数、基质胶浓度；管形成实验的hLEC接种密度、Matrigel预处理条件；成球实验的生长因子浓度、细胞数 阅读提示：Sections 2.3-2.18, and figure legends 2-5 |
| 体内实验 | 小鼠品系、周龄、性别；细胞注射数量（1×10^7）和注射部位（盲肠壁）；药物给药剂量（2 mg/kg）、途径（静脉注射）、频率（隔天一次）、持续时间（14天）；对照组（生理盐水） 阅读提示：Section 2.6 In vivo experiments, figure legends 3, 4, 6 |
| 组织学分析 | 组织固定、切片厚度（5 μm）；抗体稀释比例（需查Supporting Information Table S4）；染色试剂盒及货号；显微镜型号 阅读提示：Section 2.7-2.9, and supporting information |