建立CR小鼠模型及肿瘤模型
评估CR对肿瘤生长的影响并建立后续实验基础
对C57BL/6小鼠实施CR（逐步减少至75%），皮下接种Panc02、Hepa1-6或LLC细胞，监测肿瘤生长。
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限制肿瘤浸润中性粒细胞中的脂质积累介导热量限制诱导的抗癌效应
Restricting lipid accumulation in tumor-infiltrating neutrophils mediates caloric restriction-induced anti-cancer effects
实验完整度
高包含体外细胞实验、小鼠皮下/原位肿瘤模型、基因敲除小鼠、scRNA-seq及临床样本分析等多个独立层级，并进行功能验证和机制验证。
主要模型
C57BL/6小鼠Panc02胰腺癌皮下模型 C57BL/6小鼠Hepa1-6肝癌皮下模型 C57BL/6小鼠LLC肺癌皮下模型 中性粒细胞条件性Hilpda敲除小鼠(Hilpdafl/fl S100a8-Cre)
重点核对
CR方案：从6周龄开始，逐步将食物量减少至自由进食小鼠的75% 肿瘤接种剂量：Panc02、Hepa1-6、LLC细胞均为1×10^6个/只 中性粒细胞耗竭：腹腔注射抗Ly6G抗体200μg，每周两次 HILPDA条件性敲除：S100a8-Cre介导的Hilpdafl/fl敲除小鼠 缺氧处理：体外实验中，30分钟缺氧暴露诱导HILPDA表达
摘要
热量限制（CR）在哺乳动物中诱导肿瘤抵抗，但其机制仍知之甚少。在此，我们发现CR改变了肿瘤浸润中性粒细胞（TINs）的比例和基因表达谱。中性粒细胞的耗竭在很大程度上消除了多种小鼠癌症模型中CR诱导的肿瘤抑制，强调了它们在CR广泛抗肿瘤效应中的关键作用。CR诱导的TINs基因表达变化主要与脂质相关过程有关，特别是下调缺氧诱导脂滴相关蛋白（HILPDA）。这种下调减少了TINs中的脂质积累，通过减少向肿瘤和免疫效应细胞的脂质转移来限制肿瘤生长并增强抗肿瘤免疫。上游，CR通过降低胰岛素样生长因子1（IGF-1）减少循环中性粒细胞中缺氧诱导因子1（HIF-1α）mRNA的表达，从而限制TINs中HILPDA的表达。基线中性粒细胞HIF-1α mRNA水平低的肺癌患者对联合免疫治疗的反应更好。这些发现确定了CR诱导肿瘤抑制的一种新颖的以中性粒细胞和脂质为中心的机制，提示IGF-1/HIF-1α/HILPDA轴作为治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 热量限制如何通过调节肿瘤浸润中性粒细胞发挥抗肿瘤作用？
- 核心机制
- CR通过降低循环中IGF-1，减少中性粒细胞HIF-1α mRNA表达，进而抑制TINs中HILPDA表达，减少脂质积累，从而抑制肿瘤生长并增强抗肿瘤免疫。
- 主要证据
- 通过中性粒细胞耗竭、Hilpda条件性敲除、AAV-IGF-1回补等实验，结合scRNA-seq、脂质检测和免疫功能分析，证实了中性粒细胞及HILPDA介导的脂质积累在CR抗肿瘤效应中的关键作用。
- 研究意义
- 揭示了CR抗肿瘤的新机制，并提示IGF-1/HIF-1α/HILPDA轴可作为癌症治疗的潜在靶点，增强免疫治疗疗效。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
分析肿瘤浸润免疫细胞组成
鉴定CR对肿瘤免疫微环境的影响
通过scRNA-seq分析CR和AL小鼠肿瘤内CD45+细胞组成，并用流式验证中性粒细胞比例变化。
验证中性粒细胞在CR抗肿瘤中的作用
通过耗竭中性粒细胞检验其必要性
使用抗Ly6G抗体耗竭中性粒细胞，观察对CR诱导的肿瘤抑制的影响。
研究CR对TINs脂质代谢的影响
揭示CR调控TINs的具体分子机制
通过scRNA-seq、qPCR、Western blot、脂质染色和甘油三酯水解酶活性检测，分析CR对TINs脂质代谢的影响。
验证HILPDA在TINs中的作用
确认HILPDA介导的脂质积累对肿瘤生长的影响
使用中性粒细胞特异性Hilpda敲除小鼠（Hilpdafl/fl S100a8-Cre）研究其对肿瘤生长及CR效应的影响。
评估CR对免疫效应细胞功能的影响
验证CR是否通过减少脂质转移增强抗肿瘤免疫
分析CR小鼠或Hilpda敲除小鼠肿瘤内CD8+ T和NK细胞的IFN-γ产生及脂质水平，并进行体外共培养实验。
研究CR影响TINs的上游机制
探索CR下调HILPDA的分子通路
通过Western blot、qPCR、ELISA和细胞实验，验证CR通过降低IGF-1水平抑制HIF-1α和HILPDA表达。
评估联合免疫治疗潜力
探索降低TINs脂质积累是否能增强抗PD-1疗效
在CR或Hilpda敲除小鼠中联合抗PD-1治疗，评估肿瘤生长和生存期；同时使用ATGL激活剂SR-4995进行联合治疗。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 中性粒细胞耗竭 | 抗小鼠Ly6G抗体 | BioXCell | BE0075-1 |
| 免疫治疗 | 抗小鼠PD-1抗体 | BioXCell | BE0146 |
| 脂质检测 | BODIPY 558/568 C12 | Thermo Fisher Scientific | D3835 |
| BODIPY FL C16 | Thermo Fisher Scientific | D3821 | |
| 细胞核染色 | Hoechst 33342 | MedChemExpress | HY-15559 |
| 细胞增殖检测 | 细胞计数试剂盒-8（CCK-8） | Sigma-Aldrich | 96992 |
| 甘油三酯检测 | 甘油三酯定量检测试剂盒 | Abcam | ab65336 |
| 脂肪酶活性检测 | 脂肪酶活性检测试剂盒 | Cayman Chemical | 70064 |
| ELISA检测 | 小鼠IFN-γ ELISA试剂盒 | MultiSciences | 70-EK280/3-96 |
| 小鼠IGF-1 ELISA试剂盒 | RayBiotech | P05017 | |
| 免疫细胞分选 | EasySep小鼠中性粒细胞富集试剂盒 | STEMCELL | 19762 |
| 抗Ly6G磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-120-337 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596026 |
| 逆转录 | PrimeScript逆转录预混液 | TaKaRa | RR036A |
| 实时定量PCR | ChamQ通用型SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q711 |
| Western blot | Western blot底物 | ShareBio | SB-WB004 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | 78429 | |
| 免疫细胞分选 | EasySep小鼠T细胞分离试剂盒 | STEMCELL | 19851 |
| EasySep直接人中性粒细胞分离试剂盒 | STEMCELL | 19666 | |
| 细胞培养 | 去脂胎牛血清 | VivaCell Biosciences | C3840-0050 |
| Dulbecco改良Eagle培养基 | -- | -- | |
| Iscove改良Dulbecco培养基 | -- | -- | |
| Ham's F-12K培养基 | -- | -- | |
| 全反式维甲酸 | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| 药物处理 | CpG寡脱氧核苷酸 | InvivoGen | tlrl-1826 |
| 聚肌胞苷酸 | InvivoGen | tlrl-pic | |
| SR-4995 | AbMole | M58498 | |
| 肿瘤组织消化 | I型胶原酶 | Sigma-Aldrich | C5894 |
| IV型胶原酶 | Sigma-Aldrich | C1889 | |
| 透明质酸酶 | Sigma-Aldrich | H4272 | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Roche | 11284932001 | |
| 细胞培养 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 |
| 细胞系核转染试剂盒V | Lonza Bioscience | VCA-1003 | |
| 免疫细胞培养 | 小鼠CD3/CD28磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 11456D |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CR模型建立 | 6周龄雄性C57BL/6小鼠，CR方案逐渐减少至自由进食的75%，持续一周后开始肿瘤接种。 阅读提示：STAR Methods: CR and low-fat diet regimen |
| 肿瘤模型 | Panc02、Hepa1-6、LLC细胞皮下接种1×10^6个/只；原位胰腺模型接种2×10^6个。 阅读提示：STAR Methods: Tumor xenograft models |
| 中性粒细胞耗竭 | 抗Ly6G抗体（1A8）200μg腹腔注射，每周两次，首次在肿瘤接种前一周。 阅读提示：STAR Methods: In vivo neutrophil depletion |
| Hilpda敲除小鼠 | Hilpdafl/fl S100a8-Cre小鼠与Hilpdafl/fl对照，验证敲除效率。 阅读提示：STAR Methods: Experimental model and subject details |
| scRNA-seq | 肿瘤消化后分选CD45+细胞，10× Genomics测序，Seurat分析。 阅读提示：STAR Methods: scRNA-seq |
| 脂质检测 | BODIPY染色（10μM），流式检测；脂酶活性试剂盒。 阅读提示：STAR Methods: Determination of total lipase activity in tumor-infiltrating neutrophils |
| 免疫评估 | 肿瘤浸润CD8+ T和NK细胞IFN-γ检测，固定破膜后染色。 阅读提示：STAR Methods: Flow cytometry |
| 联合治疗 | 抗PD-1（250μg，i.p.）每周两次，共3周；联合CpG和Poly(I:C)各50μg瘤周注射；SR-4995 20μg瘤周注射。 阅读提示：STAR Methods: Anti-PD-1 immunotherapy for tumor-bearing mice |