建立AD复发小鼠模型并评估KG预防效果
建立模拟AD复发的动物模型，并验证KG处理是否具有预防复发的作用。
使用MC903诱导AD复发模型，小鼠经过初始12天MC903处理，14天停药恢复期，再连续7天MC903激发。KG组在初始治疗期外用KG乳膏。评估耳厚度、EASI评分、表皮厚度，并通过免疫组化检测CD3、NF-κB p50、TSLP表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
从结果回溯原因：NRF2驱动的GSTA4转录调控控制特应性皮炎复发中的慢性炎症与氧化应激
Retracing from Outcomes to Causes: NRF2-Driven GSTA4 Transcriptional Regulation Controls Chronic Inflammation and Oxidative Stress in Atopic Dermatitis Recurrence
实验完整度
高包含MC903诱导的AD复发小鼠模型、体外细胞过表达实验、临床样本验证、转录组测序、双荧光素酶报告基因和ChIP实验，涵盖体内体外多个证据层级并进行功能与机制验证。
主要模型
MC903诱导的AD复发小鼠模型（C57BL/6小鼠，6-8周龄，雄性） NHEK细胞（正常人表皮角质形成细胞） HaCaT细胞（人永生化角质形成细胞） 293T细胞（用于双荧光素酶报告基因实验）
重点核对
KG处理对复发模型小鼠的剂量：2.5 mg/耳，外用 MC903诱导复发模型：2 nmol MC903溶于20 μl无水乙醇，每日一次，采用5天-2天间歇-5天方案，之后停药14天，再连续7天激发 TSLP刺激浓度和时间：100 ng/ml，48小时 用于ChIP的NRF2抗体：anti-NRF2 (Cell Signaling Technology, 12721)
摘要
特应性皮炎（AD）是一种慢性复发性炎症性皮肤病，发病率高并造成巨大的经济负担。由于其潜在机制尚不清楚，预防其复发仍是皮肤病治疗中的重大挑战。在本研究中，我们采取了一种从临床结果追溯复发机制的策略。我们开发了复发性AD小鼠模型，并应用了临床验证的治疗方案。转录组分析显示，治疗组中谷胱甘肽代谢通路显著富集。通过整合生物信息学和体内验证，我们确定谷胱甘肽S-转移酶α4（GSTA4）是AD复发的关键介质。免疫组织化学分析显示，AD患者皮损中GSTA4表达降低。在功能上，体外过表达GSTA4显著抑制了AD样炎症反应和ROS产生。此外，我们发现NRF2转录活性调控GSTA4的表达和功能。我们的治疗显著增强了NRF2介导的GSTA4转录，产生了显著的抗炎和中和ROS的效果。总之，我们的研究结果表明GSTA4是AD复发中的关键因素，特别是在氧化应激和慢性炎症的背景下。靶向NRF2–GSTA4轴成为预防AD复发的一种有前景的抗炎和抗氧化策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 特应性皮炎复发的潜在机制是什么，以及KG治疗如何预防复发？
- 核心机制
- NRF2转录因子直接结合GSTA4启动子区域（+1450/+2000），促进GSTA4转录，增强其抗炎和抗氧化功能，从而抑制AD复发。
- 主要证据
- MC903诱导的AD复发小鼠模型中KG治疗后GSTA4和NRF2表达升高；临床样本中AD新发和复发皮损中GSTA4和NRF2表达降低；双荧光素酶报告基因和ChIP实验证实NRF2结合GSTA4启动子。
- 研究意义
- 靶向NRF2–GSTA4轴可能为预防AD复发提供新的抗炎和抗氧化策略，并可能作为疾病监测和复发预测的生物标志物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
转录组测序及生物信息学分析
通过比较复发模型和KG治疗组的基因表达，寻找与AD复发相关的关键通路和靶点。
取第34天耳部皮肤进行RNA-seq，筛选DEGs（P < 0.05， |log2FC| > 0.58），进行KEGG通路富集和GSEA分析。
验证GSTA4表达和ROS水平
验证GSTA4在AD复发中的表达变化及其与氧化应激的关系。
通过Western blot检测GSTA家族蛋白表达，IHC检测临床样本GSTA4表达，DHE染色检测小鼠耳部皮肤ROS水平。
体外实验验证GSTA4功能
在细胞水平验证GSTA4过表达对AD样炎症和ROS的影响。
在NHEK和HaCaT细胞中通过慢病毒感染建立GSTA4过表达稳定株，用TSLP刺激模拟AD炎症，检测Th2细胞因子（IL4, IL13）、TSLP的表达，ROS水平以及炎症信号蛋白（p-ERK, p-STAT1, p-STAT3）的表达。
研究NRF2对GSTA4的转录调控机制
探究NRF2是否直接调控GSTA4转录，以及KG是否影响这一调控。
通过数据库预测和相关性分析筛选转录因子，使用双荧光素酶报告基因实验和ChIP实验验证NRF2与GSTA4启动子结合，并检测KG处理对启动子活性的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型建立 | 卡泊三醇 | MedChemExpress | -- |
| 哈西奈德 | Sinopharm Sanyi | -- | |
| 细胞培养 | EMEM培养基 | Cytiva | SH30024.01 |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 细胞处理 | 胸腺基质淋巴细胞生成素 | -- | -- |
| 苦甘醇提物 | -- | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Ambion | -- |
| Western blot | 抗GSTA1抗体 | Affinity | DF6514 |
| 抗GSTA2抗体 | Proteintech | 10505-1-AP | |
| 抗GSTA3抗体 | Zenbio | R24520 | |
| 抗GSTA4抗体 | Affinity | DF12203 | |
| 抗NRF2抗体 | Zenbio | 380773 | |
| 抗p-ERK抗体 | Zenbio | 301245 | |
| 抗p-STAT1抗体 | Cell Signaling Technology | 9145 | |
| 抗p-STAT3抗体 | Cell Signaling Technology | 7649 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Abcam | ab8227 | |
| 抗GAPDH抗体 | Epizyme | LF206 | |
| 免疫组织化学 | 抗CD3抗体 | Abcam | ab16669 |
| 抗NF-κB p50抗体 | Abcam | ab32360 | |
| 抗TSLP抗体 | Proteintech | 13778-1-AP | |
| 抗NRF2抗体 | Abcam | ab62352 | |
| 过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（H+L） | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | |
| 免疫荧光 | DAPI染色液 | Sigma-Aldrich | D9542 |
| 抗CD4抗体 | Abcam | ab213215 | |
| 抗CD69抗体 | Abcam | ab233396 | |
| ROS检测 | 活性氧检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K138-F |
| 二氢乙啶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 流式细胞术 | CD45-BV421抗体 | BioLegend | 30-F11 |
| CD3-FITC抗体 | BioLegend | 17A2 | |
| CD4-PerCP抗体 | BioLegend | RM4-5 | |
| CD8-PE抗体 | BioLegend | 53-6.7 | |
| 活率染料APC-Cy7 | Invitrogen | 65-0865-14 | |
| CD69-PE/Cy7抗体 | BioLegend | H1.2F3 | |
| BD LSRFortessa X-20流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| RNA-seq | Agilent扫描仪（G2505C） | Agilent Technologies | -- |
| 质粒构建 | BglII限制性内切酶 | Thermo Fisher Scientific | ER00815 |
| SalI限制性内切酶 | Thermo Fisher Scientific | ER0641 | |
| pProUTR-Reporter载体 | HarO | TProUTRRep01 | |
| 双荧光素酶报告基因 | 双荧光素酶报告检测系统 | Promega | -- |
| ChIP实验 | 抗NRF2抗体（ChIP级） | Cell Signaling Technology | 12721 |
| 正常兔IgG | Cell Signaling Technology | 2729 | |
| KG质量控制 | 甘草苷标准品 | Yuanye Bio-Technology | B20414 |
| 氧化苦参碱标准品 | Yuanye Bio-Technology | S31408 | |
| 槐定碱标准品 | Yuanye Bio-Technology | B50585 | |
| Vanquish超高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Orbitrap Q Exactive HFX质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒-8 | -- | -- |
| Multiskan Spectrum酶标仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | MC903剂量、给药方式、给药时间、小鼠品系、性别、年龄、组别设置、KG和HC剂量 阅读提示：Materials and Methods - Animals and treatment, Figure 1a |
| 转录组测序 | 样本来源、RNA提取方法、测序平台、DEGs筛选阈值 阅读提示：Materials and Methods - RNA sequencing and bioinformatics analysis, Figure 2a, Supplementary Figure S2 |
| 细胞实验 | 细胞系来源、培养基、TSLP刺激浓度和时间、GSTA4/NRF2过表达方法、ROS检测方法 阅读提示：Materials and Methods - Cell culture and treatment, Transfection, Figure 3, Supplementary Figure S6 |
| 双荧光素酶报告基因实验 | 启动子片段构建、转染细胞系、KG处理浓度、报告基因检测系统 阅读提示：Materials and Methods - Luciferase report assay, Figure 4f-g |
| ChIP实验 | 细胞类型、抗体、引物序列、PCR条件 阅读提示：Materials and Methods - Chromatin immunoprecipitation PCR, Figure 4h-i |
| 临床样本 | 样本来源、分组、染色方法 阅读提示：Materials and Methods - Clinical samples, Figure 2f, Supplementary Figure S5 |