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        乙酸在睡眠中断期间促进代谢适应性和认知表现

        Acetate enables metabolic fitness and cognitive performance during sleep disruption

        作者信息Qinqin He, Liwei Ji, Yanyan Wang, Yarong Zhang, Haiyan Wang, Junyan Wang, Qing Zhu, Maodi Xie, Wei Ou, Jun Liu, Kuo Tang, Kening Lu, Qingmei Liu, Jian Zhou, Rui Zhao, Xintian Cai, Nanfang Li, Yang Cao, Tao Li
        PMID39163862
        期刊Cell Metab
        发布时间2024-09-03
        DOI10.1016/j.cmet.2024.07.019
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        包含体外星形胶质细胞实验、小鼠SF模型、遗传学操作（Acss1敲除/敲低/过表达）、多种行为学和组织学检测，以及人体样本分析，并验证了机制。

        主要模型

        C57BL/6J小鼠睡眠碎片化模型 原代下丘脑星形胶质细胞 星形胶质细胞特异性Acss1敲除小鼠

        重点核对

        睡眠碎片化诱导：使用轨道转子，110转/分，10秒开/110秒关，仅在光照期（7:00-19:00）进行，持续14天 乙酸给药：口服乙酸钠1.0 mg/g/天，持续14天；或脑室内输注20 mM乙酸钠（0.5 μL/h）通过微型渗透泵 代谢评估：空腹血糖、葡萄糖耐量试验（2 g/kg葡萄糖腹腔注射）、胰岛素耐量试验（0.75 U/kg胰岛素腹腔注射） 认知评估：Morris水迷宫和新物体识别测试

        摘要

        睡眠对整体健康至关重要，其紊乱与代谢、认知和心血管功能障碍风险增加相关；然而，其分子机制仍知之甚少。本研究使用慢性睡眠碎片化（SF）小鼠模型，探讨睡眠紊乱如何导致代谢失衡和认知损伤。与对照组相比，SF小鼠表现出认知、葡萄糖代谢和胰岛素敏感性受损。我们确定下丘脑星形胶质细胞中乙酸水平升高是SF小鼠的防御性反应。通过乙酸输注或星形胶质细胞特异性Acss1缺失来升高乙酸水平，我们观察到SF小鼠的代谢和认知损伤得到缓解。机制上，乙酸结合并激活丙酮酸羧化酶，从而恢复糖酵解和三羧酸循环。在受SF影响最严重的个体中，阻塞性睡眠呼吸暂停合并2型糖尿病的患者表现出升高的乙酸水平。我们的研究揭示了乙酸对睡眠诱导的代谢和认知损伤的保护作用。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        睡眠碎片化如何导致代谢和认知损伤？乙酸在这一过程中扮演什么角色？
        核心机制
        乙酸通过结合并激活丙酮酸羧化酶（PC），促进糖酵解和三羧酸循环，从而改善SF诱导的代谢和认知损伤。
        主要证据
        SF小鼠下丘脑乙酸水平升高，乙酸补充或Acss1缺失（提高乙酸水平）可改善葡萄糖代谢和认知；乙酸结合并激活PC（结合位点位于第782-831氨基酸区域），PC敲低逆转了保护效应。
        研究意义
        研究揭示乙酸对睡眠紊乱诱导的代谢和认知损伤的保护作用，为睡眠障碍合并代谢疾病的治疗提供了潜在靶点。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        建立慢性睡眠碎片化模型并评估表型

        确定SF对小鼠认知和代谢的影响

        对7-8周龄雄性C57BL/6J小鼠进行14天SF处理（轨道转子，光照期110转/分，10秒开/110秒关），对照组不干扰。之后进行代谢和认知评估。

        2

        检测SF小鼠系统性代谢和认知损伤

        评估SF对葡萄糖代谢、胰岛素敏感性、认知功能的影响

        通过空腹血糖、GTT、ITT、HOMA-IR评估葡萄糖代谢和胰岛素敏感性；通过Morris水迷宫和新物体识别评估认知功能。

        3

        分析下丘脑代谢物和乙酸水平

        鉴定SF小鼠下丘脑代谢变化，特别是乙酸水平

        通过代谢组学分析血浆，发现SF小鼠乙酸升高；通过比色法检测下丘脑乙酸水平，发现其升高。通过13C-NMR分析乙酸氧化和TCA循环贡献。

        4

        补充乙酸或提高内源性乙酸水平

        测试乙酸升高对SF小鼠代谢和认知损伤的影响

        通过口服乙酸钠或脑室内输注乙酸钠，或通过星形胶质细胞特异性Acss1敲除/敲低来升高乙酸水平，然后评估代谢和认知功能。

        5

        验证PC在乙酸功能中的作用

        确定乙酸是否通过激活PC来介导其保护作用

        在原代星形胶质细胞中，乙酸处理增加PC活性；通过分子对接模拟乙酸结合PC位点；构建PC缺失突变体验证第782-831位氨基酸为关键区域；在Acss1 cKO小鼠中敲低PC，观察是否逆转乙酸效应。

        6

        验证乙酸对已存在损伤的治疗效果及人体关联

        测试乙酸补充对已建立的SF小鼠的治疗效果，并在人体中验证乙酸与葡萄糖稳态的关联

        对SF 28天的小鼠在最后14天口服乙酸，评估其改善作用；在OSA和OSA+T2D患者中检测血浆乙酸水平，并进行遗传关联分析（LDSC和eQTL分析）。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        评估整体代谢和认知
        葡萄糖耐量试验胰岛素耐量试验Morris水迷宫新物体识别测试
        检测分子和代谢变化
        蛋白质印迹代谢组学13C核磁共振波谱酶活性测定
        验证遗传和功能调节
        条件性敲除AAV介导的敲低慢病毒转导电生理记录
        分析人体样本和遗传关联
        靶向代谢组学连锁不平衡评分回归表达数量性状位点分析

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        睡眠碎片化诱导定制装置（ZS-SM-II）zslabZS-SM-II
        血糖测量ACCU-CHEK Active®血糖仪Roche Diagnostics--
        葡萄糖和胰岛素注射葡萄糖Sigma--
        胰岛素Sigma--
        PET成像18F-氟代脱氧葡萄糖----
        乙酸测定乙酸比色测定试剂盒（#MAK086）SigmaMAK086
        乙酸给药乙酸钠（#S2889）SigmaS2889
        脑室内给药Alzet微型渗透泵（#2002）Alzet2002
        抗体抗Akt抗体（#60203-2-Ig）Proteintech60203-2-Ig
        抗磷酸化Akt(Ser473)抗体（#4060）CST4060
        抗mTOR抗体（#66888-1-Ig）Proteintech66888-1-Ig
        抗磷酸化mTOR(Ser2448)抗体（#5536）CST5536
        抗ACSS1抗体（#17138-1-AP）Proteintech17138-1-AP
        抗ACSS2抗体（#16087-1-AP）Proteintech16087-1-AP
        抗GLUT1抗体（#66290-1-Ig）Proteintech66290-1-Ig
        抗GLUT3抗体（#20403-1-AP）Proteintech20403-1-AP
        Western blotPVDF膜Millipore--
        蛋白质定量BCA蛋白测定试剂盒Sigma--
        原代细胞培养DMEM/F-12培养基GIBCO--
        胎牛血清GIBCO--
        青霉素/链霉素（#15140-122）GIBCO15140-122
        ELISA小鼠皮质酮ELISA试剂盒（#RXJ202703M）RuixinbioRXJ202703M
        小鼠瘦素ELISA试剂盒（#RX20624M）RuixinbioRX20624M
        小鼠GLP-1 ELISA试剂盒（#RX203401M）RuixinbioRX203401M
        小鼠脂联素ELISA试剂盒（#RX202420M）RuixinbioRX202420M
        抗生素处理万古霉素（#627850）Sigma627850
        庆大霉素（#345814-M）Sigma345814-M
        利福平（#R3501）SigmaR3501
        GLP-1抑制艾塞那肽片段9-39Sigma--
        病毒注射AAV9-GFAP-shAcss1-EGFP（#GIDV0236744）GenechemGIDV0236744
        AAV9-hMAG-shAcss1（#GIDV0392773）GenechemGIDV0392773
        AAV9-CD68-shAcss1-EGFP（#GIDV0392553）GenechemGIDV0392553
        AAV9-GFAP-Acss1OE-EGFP（#GOSV0392555）GenechemGOSV0392555
        AAV9-GFAP-HK2OE（#GOSV0395463）GenechemGOSV0395463
        AAV9-GFAP-shPC-EGFP（#GIDV0340439）GenechemGIDV0340439
        AAV9-EGFPGenechem--
        示踪AAV1-hSyn-EGFP（#PT-1990）BrainVTAPT-1990
        AAV5-GfaABC1D-Cre（#PT-1899）BrainVTAPT-1899
        retroAAV-hSyn-FLP（#PT-0341）BrainVTAPT-0341
        AAV9-EF1a-fDIO-hM3D(Gq)-EGFP（#PT-1040）BrainVTAPT-1040
        AAV9-EF1a-fDIO-EGFP（#PT-1047）BrainVTAPT-1047
        电生理氯氮平-N-氧化物（#A3317）ApexBioA3317
        振动切片机（VT 1200S）Leica--
        13C示踪[1,6-13C]葡萄糖（#CLM-2717-MPT-PK）Cambridge Isotope LaboratoriesCLM-2717-MPT-PK
        [1,2-13C]乙酸（#CLM-440-MPT-PK）Cambridge Isotope LaboratoriesCLM-440-MPT-PK
        ATP检测ATP检测系统（#S0027）BeyotimeS0027
        蛋白质组学Exploris 480™质谱仪Thermo Fisher Scientific--
        EASY-nLC 1200超高效液相色谱系统Thermo Fisher Scientific--
        16S rRNA测序PowerSoil DNA提取试剂盒（#27100-4-EP）QIAGEN27100-4-EP
        高保真PCR系统试剂盒（#3553400001）Roche3553400001
        QIAquick凝胶回收试剂盒（#28704）QIAGEN28704
        Illumina MiSeq PE300测序平台Illumina--
        代谢组学HM350代谢组学平台----
        Western blotChemiDocTM MP成像系统Bio-Rad--
        免疫荧光多聚-L-赖氨酸（#P4707）SigmaP4707
        含DAPI的封片剂Vector Laboratories--
        抗GFAP抗体（#16825-1-AP）Proteintech16825-1-AP
        抗NeuN抗体（#66836-1-Ig）Proteintech66836-1-Ig
        抗Olig2抗体（#13999-1-AP）Proteintech13999-1-AP
        抗Iba1抗体（#016-26721）Wako016-26721
        抗GLUT1抗体（#NB110-39113）NovusNB110-39113
        抗GLUT3抗体（#NBP2-66872）NovusNBP2-66872
        免疫组织化学抗Occludin抗体（#27260-1-AP）Proteintech27260-1-AP
        DAB显色液（#ZLI-9017）ZSGB-BIOZLI-9017
        炎症因子检测多重检测试剂盒（MHSTCMAG-70K）MilliporeMHSTCMAG-70K
        TNF-α ELISA试剂盒（#E-EL-M3063）ElabscienceE-EL-M3063
        IL-6 ELISA试剂盒（#E-EL-M0044c）ElabscienceE-EL-M0044c
        qRT-PCRTRIzol试剂（#R401-01）Vazyme BiotechR401-01
        Omniscript逆转录试剂盒（#R323-01）Vazyme BiotechR323-01
        SYBR Green荧光染料Bio-Rad--
        酶活性检测己糖激酶检测试剂盒（#BC0745）SolarbioBC0745
        慢病毒包装pLKO.1载体----
        psPAX2包装质粒----
        pMD2.G包膜质粒----
        慢病毒转染聚凝胺（#TR-1003）SigmaTR-1003
        脂肪酸摄取Bodipy荧光脂肪酸（#D3823）InvitrogenD3823
        糖酵解通量Seahorse XF24细胞外通量分析仪Agilent Technologies--
        CellTak细胞粘附剂Corning Inc.--
        寡霉素ASigma--
        2-脱氧葡萄糖Sigma--
        13C示踪WZB117（#SML0621）SigmaSML0621
        [U-13C6]葡萄糖（#CLM-1396-PK）Cambridge Isotope LaboratoriesCLM-1396-PK
        [U-13C5]谷氨酸（#CLM-3949-PK）Cambridge Isotope LaboratoriesCLM-3949-PK
        RPMI 1640培养基（#31800）Solarbio31800
        GC-MSAgilent 7890B气相色谱系统Agilent Technologies--
        433UI P-5MS毛细管柱Agilent J&W Scientific--
        Agilent 19091S质谱仪Agilent Technologies--
        SCFA分析DB-FFAP色谱柱J&W Scientific--
        Agilent 7000D质谱仪Agilent Technologies--
        混合溶剂分子动力学模拟AMBER 20软件----
        PC突变体构建pRK7-HA载体（#8993）Addgene8993
        Mut Express II快速突变试剂盒V2（#C214）Vazyme BiotechC214
        TSnanofect V2转染试剂Tsingke Biotech--
        抗HA抗体（#F1804）SigmaF1804

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        睡眠碎片化模型
        小鼠品系、年龄、性别；SF设备参数（转速、开关时间、持续周期）；光照周期
        阅读提示：STAR★Methods - Chronic sleep fragmentation, Figure 1A
        乙酸给药
        给药途径（口服或脑室内）；剂量（1.0 mg/g/天或20 mM，0.5 μL/h）；持续时间和频率
        阅读提示：STAR★Methods - Acetate administration
        代谢评估
        禁食时间；葡萄糖或胰岛素剂量；检测时间点；样本量
        阅读提示：STAR★Methods - Glucose and insulin tolerance tests, Figure 1C-D
        认知评估
        Morris水迷宫平台位置、训练天数；新物体识别训练和测试时间；排除标准（总探索时间<20秒）
        阅读提示：STAR★Methods - Morris water maze, Novel object recognition test
        星形胶质细胞Acss1敲除/敲低
        基因敲除策略（floxed小鼠与Cre品系）；病毒载体（AAV9-GFAP-shAcss1）；注射坐标和体积；病毒滴度
        阅读提示：STAR★Methods - Stereotaxic injections, Figure 4

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