患者样本分析及细菌分离鉴定
探究KLP与溃疡性结肠炎的关系，并分离获得可能的致病菌株。
使用荧光原位杂交和定量PCR分析UC患者结肠组织中KLP的丰度及与Mayo指数的关系；从UC患者结肠组织中分离细菌，通过16S rRNA测序鉴定主要菌群，并分离KLPJ菌株。
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肺炎克雷伯菌通过Caspase-11介导的肠上皮细胞IL18诱导炎症性肠病
Klebsiella pneumoniae Induces Inflammatory Bowel Disease Through Caspase-11-Mediated IL18 in the Gut Epithelial Cells
实验完整度
高包含患者样本分析、细菌分离鉴定、多种基因敲除小鼠模型、肠道类器官培养、体内外功能实验及机制验证等多层级证据。
主要模型
C57BL/6小鼠及多种基因敲除小鼠（caspase-1/11-/-、NLRP3-/-、NLRC4-/-、IL18-/-、IL22-/-） SPF小鼠和抗生素处理小鼠模型 小鼠和人类肠道类器官（organoid） 溃疡性结肠炎患者结肠组织样本
重点核对
KLPJ菌株的分离来源和鉴定（K pneumoniae JCM1662） 小鼠模型中KLPJ灌胃剂量（109 CFU/只）和给药频率（每周一次） DSS诱导结肠炎的浓度（非抗生素处理小鼠2.5%，抗生素处理小鼠2.0%）和持续时间（7天） IL18阻断试剂（IL18 Binding protein isoform d）的剂量（75 μg/kg）和给药途径（尾静脉注射） 骨髓移植实验中辐照剂量（800 cGy）和移植细胞数（2 × 10^6细胞/只）
摘要
背景与目的：肺炎克雷伯菌（KLP）是一种属于肠杆菌科的革兰氏阴性细菌，是住院患者中抗菌药物耐药机会性感染的常见原因。KLP可定植于人体胃肠道，尤其是炎症性肠病患者。然而，KLP对炎症性肠病发生和发展的影响仍不清楚。方法：我们使用定量逆转录聚合酶链反应和内镜检查分析了溃疡性结肠炎的Mayo指数与KLP之间的关系。使用caspase-1/11-/-、NLRP3-/-、NLRC4-/-、白介素（IL）18-/-和IL22-/-小鼠，我们证明了KLP可通过caspase-11介导的成熟IL18释放诱导结肠炎。通过体外肠道类器官培养，我们确定了KLP诱导结肠炎的机制。结果：我们首先发现溃疡性结肠炎的Mayo指数与KLP之间呈正相关。然后，我们从结肠炎患者的结肠组织中分离出一株KLP，命名为肺炎克雷伯菌J（KLPJ）。该菌株可在结肠上皮细胞和肠道类器官中诱导成熟IL18的产生，并可诱导结肠炎并促进葡聚糖硫酸钠介导的结肠炎。使用caspase-1/11-/-、NLRP3-/-、NLRC4-/-、IL18-/-和IL22-/-小鼠，我们证明了KLPJ介导的结肠炎通过caspase-11的激活发生，并依赖于IL18，部分依赖于IL22。我们的数据还表明，KLPJ的脂多糖可与caspase-11结合，在小鼠和人结肠类器官中诱导成熟IL18。结论：来自溃疡性结肠炎患者结肠组织的KLPJ可定植于结肠，激活caspase-11炎性小体，并促进肠道炎症。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肺炎克雷伯菌（KLP）对炎症性肠病（IBD）发生发展的影响及其分子机制尚不清楚，本研究旨在探究KLP是否及如何诱导结肠炎。
- 核心机制
- KLPJ通过其脂多糖（LPS）与caspase-11结合，激活非经典炎性小体，促进肠上皮细胞中成熟IL18的释放，进而诱导和加重结肠炎，该过程不依赖于NLRP3或NLRC4。
- 主要证据
- 从UC患者结肠组织分离的KLPJ菌株可在小鼠结肠定植并诱导结肠炎；在caspase-1/11敲除小鼠中KLPJ不诱导结肠炎；IL18敲除小鼠免受KLPJ诱导的结肠炎；骨髓移植实验表明肠上皮细胞来源的IL18起主要作用；体外类器官实验证明KLPJ的LPS与caspase-11结合并激活caspase-1。
- 研究意义
- 本研究揭示了KLPJ、肠上皮细胞和肠道免疫细胞之间的相互作用，为KLP在IBD等肠道疾病发展中的作用提供了新的见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
小鼠结肠炎模型验证KLPJ致病性
验证分离的KLPJ菌株是否能诱导或加重结肠炎。
将KLPJ通过口腔灌胃给予SPF小鼠或抗生素处理小鼠，监测体重、生存率、结肠长度、DAI和组织学损伤；使用DSS诱导结肠炎模型，评估KLPJ对结肠炎严重程度的影响。
免疫细胞分析
探究KLPJ诱导结肠炎时肠道免疫细胞的变化。
通过流式细胞术分析结肠固有层中CD11b+Ly6G+中性粒细胞、Th1细胞（CD4+IFNγ+）、NK细胞（NKp46+IFNγ+）和炎症性巨噬细胞（CD11b+MHCII+Ly6C+）的比例。
基因敲除小鼠验证机制
确定KLPJ诱导结肠炎所依赖的宿主因子。
使用caspase-1/11-/-、NLRP3-/-、NLRC4-/-、IL18-/-和IL22-/-小鼠，观察KLPJ灌胃后结肠炎表型的变化；使用IL18中和抗体或IL18结合蛋白阻断IL18，观察对结肠炎的影响。
骨髓移植实验
明确IL18的来源是肠上皮细胞还是造血细胞。
将IL18 KO或WT小鼠的骨髓细胞移植到经辐照的WT或IL18 KO受体小鼠中，然后进行KLPJ灌胃和DSS处理，比较结肠炎表型差异。
类器官培养及机制研究
在体外模型中确认KLPJ-LPS与caspase-11的结合及其对IL18释放的作用。
培养小鼠和人类肠道类器官，通过显微注射或共培养将KLPJ或LPS引入类器官，检测LPS与caspase-11/caspase-4的结合、caspase-1的活化及IL18的分泌。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫印迹和免疫染色 | 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（H+L） | zsbio | ZB2305 |
| 抗小鼠β-肌动蛋白（C4） | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| 抗小鼠IL18 | Abcam | ab71495 | |
| 抗小鼠CD11b（1B6e） | Santa Cruz Biotechnology | sc-21744 | |
| 抗小鼠/人caspase-1 | Proteintech | 22915-1-Ap | |
| 抗小鼠caspase-11（17D9） | Cell Signaling Technology | 14340 | |
| 抗LPS | Abcam | ab35654 | |
| 抗人caspase-4（4B9） | Santa Cruz Biotechnology | sc-56056 | |
| 抗小鼠/人NLRP3（EPR23094-1） | Abcam | ab263899 | |
| 抗小鼠/人NLRC4 | Invitrogen | PA5-88997 | |
| 抗小鼠IL1β | ABclonal Biotechnology | A11369 | |
| 抗小鼠CD45.1（A20） | Abcam | ab25078 | |
| 抗小鼠CD45.2（104） | Invitrogen | 14-0454-85 | |
| 抗磷酸化ezrin | Affinity | AF3172 | |
| 抗villin | Proteintech | 16488-1-AP | |
| 流式细胞术 | Brilliant Violet 421抗小鼠CD45（30-F11） | BioLegend | 103133 |
| PE抗小鼠MHCII（M5/114.15.2） | BioLegend | 107608 | |
| APC抗小鼠Ly6C（HK1.4） | BioLegend | 128016 | |
| FITC抗小鼠CD4（RM4-5） | Thermo Fisher Scientific | 11-0042-85 | |
| PE抗小鼠IFNγ（XGM1.2） | Thermo Fisher Scientific | 25-7311-82 | |
| FITC抗小鼠NKp46（29A1.4） | BioLegend | 137606 | |
| FITC抗小鼠F4/80（BM8） | BioLegend | 123108 | |
| FITC抗小鼠CD11b（M1/70） | Thermo Fisher Scientific | 11-0112-82 | |
| APC抗小鼠TNFα（MP6-XT22） | Thermo Fisher Scientific | 17-7321-82 | |
| PE抗小鼠Ly6G（1A8） | BD Bioscience | 551461 | |
| FITC抗小鼠Ly6C（AL-21） | BD Bioscience | 553104 | |
| APC抗小鼠CD45（30-F11） | BioLegend | 103112 | |
| Brilliant Violet 605抗小鼠CD103（2E7） | BioLegend | 121433 | |
| PCR检测 | 16s 27F引物 | BGI | -- |
| 16s 1492R引物 | BGI | -- | |
| 荧光原位杂交 | Kp-JCM 1662探针 | Synbio Technologies | -- |
| 对照探针 | Synbio Technologies | -- | |
| ELISA | 小鼠IL18 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0730c |
| 小鼠IL1β ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0037c | |
| 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | Elabscience | E-MSEL-M0002 | |
| 小鼠IL6 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0044c | |
| 人IL18 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-H0253c | |
| PCR纯化 | QIAquick PCR纯化试剂盒 | Qiagen | 28104 |
| 实时定量PCR | QuantiTect SYBR Green PCR预混液 | Qiagen | 208052 |
| 细胞刺激 | 细胞刺激混合物 | eBioscience | 00-4975-03 |
| 流式细胞术 | 透化缓冲液 | Thermo Fisher | 00-8333-56 |
| 免疫印迹 | ECL化学发光试剂 | Absin | abs920 |
| 蛋白提取 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | P8340 |
| DSS诱导结肠炎 | 葡聚糖硫酸钠 | Mpbio | 160110 |
| 抗生素处理 | 万古霉素 | Sigma-Aldrich | V2002 |
| 硫酸新霉素 | Sigma-Aldrich | N6386 | |
| 甲硝唑 | Sigma-Aldrich | M3761 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Life Technologies | 15596026 |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Gibco | 10099141 |
| 细胞分离 | 胶原酶IV | Sigma-Aldrich | C5138 |
| 脱氧核糖核酸酶I | Solarbio | D8071 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11965118 |
| Hank's平衡盐溶液 | Gibco | 14170161 | |
| 细胞分离 | Percoll分离液 | Solarbio | P8370 |
| 细胞刺激 | 佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯 | Sigma-Aldrich | 79346 |
| GolgiStop | BD Biosciences | 554724 | |
| 体外刺激 | 三磷酸腺苷 | Sigma-Aldrich | FLAAS |
| 免疫沉淀 | Pierce蛋白A/G磁珠 | Thermo Fisher | 88803 |
| 类器官培养 | 温和细胞解离试剂 | STEMCELL | 07174 |
| 染色 | 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 | SouthernBiotech | 0100-20 |
| 类器官培养 | Y-27632 | MCE | HY-10583 |
| IntestiCult小鼠类器官生长培养基试剂盒 | STEMCELL | 06005 | |
| IntestiCult人类类器官生长培养基试剂盒 | STEMCELL | 06010 | |
| 细胞分离 | 细胞筛网 | Biosharp | BS-70-XBS |
| 类器官培养 | Matrigel基质胶 | Corning | 356231 |
| DMEM/F12培养基 | STEMCELL | 36254 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细菌菌株和培养 | KLPJ菌株的分离来源、培养条件（LB培养基，37°C震荡过夜）、储存条件（25%甘油-20°C） 阅读提示：Methods: Bacterium Stains |
| 小鼠模型 | 小鼠品系（C57BL/6）和年龄（4-6周）、饲养条件（SPF）、抗生素处理方案（氨苄青霉素1 g/L，万古霉素0.5 g/L，新霉素1 g/L，甲硝唑1 g/L通过饮水1周）、细菌灌胃剂量（200 μL 1×10^9 CFU/只，每周一次） 阅读提示：Methods: Mice, Mouse Models |
| DSS诱导结肠炎 | DSS浓度（非抗生素处理小鼠2.5%，抗生素处理小鼠2.0%）、DSS处理时间（7天） 阅读提示：Methods: Mouse Models |
| IL18阻断实验 | IL18阻断试剂（IL18 Binding protein isoform d）剂量（75 μg/kg）、给药途径（尾静脉注射）、给药时间 阅读提示：Methods: Mouse Models |
| 骨髓移植 | 辐照剂量（800 cGy单次）、骨髓细胞注射数量（2×10^6细胞/只）、注射途径（尾静脉） 阅读提示：Methods: Mouse Models |
| 类器官培养 | 类器官培养条件（Matrigel基质胶，培养基种类，生长因子，培养时间：小鼠6天，人9天）、细菌显微注射浓度（107/mL）和刺激条件（KLPJ或E coli 1×10^7 CFU/mL或LPS 1 mg/mL，刺激3小时） 阅读提示：Methods: Gut Organoid Culture |
| 免疫细胞分析 | 结肠固有层免疫细胞分离方法（胶原酶IV消化）、流式细胞术抗体组合和门控策略 阅读提示：Methods: Cell Isolation and Flow Cytometry |