构建XBP1或IRE1α缺陷肿瘤细胞系
探究XBP1或IRE1α在肿瘤生长和免疫调节中的作用。
通过慢病毒转导shRNA敲低XBP1或HMGCR，利用CRISPR/Cas9敲除IRE1α和N-SMase，在B16、B16-OVA和MC38-OVA细胞中建立稳定敲低或敲除细胞系。
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癌细胞内在的XBP1通过促进胆固醇产生驱动肿瘤内髓系细胞的免疫抑制性重编程
Cancer cell-intrinsic XBP1 drives immunosuppressive reprogramming of intratumoral myeloid cells by promoting cholesterol production
实验完整度
高包含细胞系体外实验、小鼠移植瘤模型、基因敲除/敲低、转录组与脂质组学、ChIP和荧光素酶报告基因、体内药理学抑制及免疫细胞分析等多个独立证据层级，并进行功能与机制验证。
主要模型
MC38-OVA小鼠结肠癌细胞系 B16-OVA小鼠黑色素瘤细胞系 C57BL/6J小鼠皮下移植瘤模型 免疫缺陷小鼠（Rag1-/-、NCG）模型
重点核对
XBP1敲低或IRE1α敲除对肿瘤生长的影响是否依赖适应性免疫（在免疫缺陷小鼠中验证） XBP1敲低对肿瘤浸润MDSC和CD8+ T细胞比例的影响 胆固醇或HMGCR敲低对MDSC扩增和肿瘤生长的影响 sEV递送胆固醇及GW4869抑制sEV生成对MDSC和肿瘤生长的影响 KIRA8（IRE1α抑制剂）单用或与抗PD-1联用的抗肿瘤效果
摘要
肿瘤组织中的恶劣微环境会破坏内质网稳态并诱导未折叠蛋白反应（UPR）。癌细胞和肿瘤浸润白细胞中的慢性UPR可能促进免疫监视的逃逸。然而，癌细胞中的UPR如何削弱抗肿瘤免疫反应尚不清楚。在此，我们证明在癌细胞中，UPR组分X-box结合蛋白1（XBP1）有利于胆固醇的合成和分泌，胆固醇激活髓源性抑制细胞（MDSCs）并引起免疫抑制。胆固醇以小型细胞外囊泡的形式递送，并通过巨胞饮作用被MDSCs内化。基因或药理学去除XBP1或降低肿瘤胆固醇含量可显著减少MDSCs数量并触发强烈的抗肿瘤反应。因此，我们的数据揭示了XBP1/胆固醇信号在肿瘤生长调控中的细胞非自主作用，并提示抑制该信号可能是提高癌症免疫治疗疗效的有效策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 癌细胞中的UPR组分XBP1如何通过影响肿瘤微环境中的免疫细胞来促进肿瘤生长？
- 核心机制
- 癌细胞中的XBP1作为转录因子直接结合胆固醇合成相关基因（HMGCR、HMGCS1等）的启动子，促进胆固醇合成；胆固醇经小型细胞外囊泡（sEV）分泌并被MDSC通过巨胞饮作用内化，激活MDSC，进而抑制CD8+ T细胞抗肿瘤免疫。
- 主要证据
- 通过皮下移植瘤模型证明XBP1敲低或IRE1α敲除抑制肿瘤生长且依赖适应性免疫；流式细胞术显示MDSC减少和CD8+ T细胞增加；RNA-seq和脂质组学显示胆固醇合成通路下调；ChIP和荧光素酶报告基因验证XBP1直接结合胆固醇合成基因启动子；sEV分离和GW4869抑制实验证明胆固醇经sEV传递；KIRA8和抗PD-1联合治疗增强抗肿瘤效果。
- 研究意义
- 本研究揭示XBP1/胆固醇信号在肿瘤免疫抑制中的细胞非自主作用，提出靶向该信号通路可能是提高癌症免疫治疗疗效的有效策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
皮下移植瘤模型评估肿瘤生长
验证XBP1或IRE1α缺陷对肿瘤生长的影响，并检验是否依赖适应性免疫。
将shNT、shXBP1或IRE1α-KO肿瘤细胞皮下注入C57BL/6J或免疫缺陷小鼠（Rag1-/-、NCG），监测肿瘤生长和生存期。
免疫微环境分析
确定XBP1缺陷对肿瘤浸润免疫细胞组成和功能的影响。
从肿瘤中分离白细胞，通过质谱流式、流式细胞术分析MDSC、CD8+ T细胞、巨噬细胞等亚群，并检测MDSC功能标志物（p-STAT3、iNOS）和CD8+ T细胞活化标志物（IFNg、GZMB）。
转录组和脂质组学分析
鉴定XBP1调控的下游通路和代谢物，特别是胆固醇合成相关基因和脂质变化。
对shNT和shXBP1 MC38-OVA肿瘤进行RNA-seq和脂质组学分析，筛选差异表达基因和差异脂质，并进行KEGG通路富集。
验证XBP1对胆固醇合成基因的直接转录调控
证明XBP1s直接结合胆固醇合成基因启动子并激活其转录。
在293T细胞中过表达XBP1s，进行ChIP实验检测与HMGCR、HMGCS1等启动子的结合；利用荧光素酶报告基因系统验证XBP1s对启动子活性的激活作用，并突变结合位点验证特异性。
体外验证胆固醇对MDSC的扩增和激活作用
检测胆固醇是否直接促进MDSC的扩增和活化。
从小鼠骨髓细胞中分离并诱导MDSC分化，加入胆固醇或MβCD处理，检测MDSC比例、STAT3磷酸化、iNOS mRNA和ROS水平。
体内验证胆固醇合成抑制对肿瘤生长和免疫的影响
通过基因或药理学手段抑制胆固醇合成，验证其对肿瘤生长和免疫微环境的影响。
使用shHMGCR敲低细胞或给予HMGCR抑制剂辛伐他汀，监测肿瘤生长、MDSC和CD8+ T细胞比例。
验证sEV介导胆固醇从肿瘤细胞到MDSC的传递
确定胆固醇是通过sEV分泌并传递给MDSC，以及MDSC通过巨胞饮作用内化sEV。
从缺氧处理的肿瘤细胞条件培养基中分离sEV，用PKH67标记后与MDSC共孵育，使用内吞抑制剂（amiloride、EIPA、chlorpromazine）处理，检测MDSC对sEV的摄取、MDSC扩增和活化。并使用GW4869抑制sEV生成或N-Smase敲除，体内验证sEV在免疫抑制中的作用。
药理学抑制IRE1α/XBP1通路及联合免疫治疗
评估KIRA8（IRE1α抑制剂）单用或与抗PD-1联合的抗肿瘤效果。
在B16-OVA或MC38-OVA移植瘤模型中给予KIRA8和/或抗PD-1抗体，监测肿瘤生长、生存期和免疫细胞变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | PAN-Biotech | ST30-3320 | |
| 青霉素和链霉素 | -- | -- | |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 动物模型 | 基质胶 | BD Biosciences | 356231 |
| 药物处理 | 辛伐他汀 | -- | -- |
| KIRA8 | WuXi AppTec | -- | |
| 流式分析 | 抗小鼠CD16/32抗体 | BioLegend | -- |
| I型胶原酶 | Sigma | -- | |
| DNA酶I | Roche | -- | |
| 固定缓冲液 | BD Biosciences | -- | |
| 透化缓冲液 | eBioscience | -- | |
| 细胞增殖 | CFSE | BioLegend | -- |
| 胆固醇检测 | 胆固醇细胞检测试剂盒 | Cayman | -- |
| 胆固醇提取试剂盒 | Sigma | -- | |
| Amplex Red检测试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| sEV分离 | PKH67绿色荧光标记试剂盒 | Sigma-Aldrich | MINI67 |
| sEV分析 | NanoSight NS300纳米颗粒追踪分析仪 | Malvern Panalytical | -- |
| 免疫印迹 | 抗XBP-1s抗体 | CST | 12782 |
| 抗Stat3抗体 | CST | 9139 | |
| 抗磷酸化Stat3抗体 | CST | 9131 | |
| 抗β-actin抗体 | CST | 4967 | |
| ChIP | SimpleChIP Plus酶法染色质免疫沉淀试剂盒 | Cell Signaling | -- |
| RT-qPCR | TRNzol Universal Reagent | TIANGEN | -- |
| FastKing RT试剂盒（含gDNase） | TIANGEN | -- | |
| SuperReal PreMix Plus（SYBR Green） | TIANGEN | -- | |
| 免疫细胞分选 | MojoSort小鼠CD8 T细胞分选试剂盒 | BioLegend | -- |
| 髓源性抑制细胞分选试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 细胞因子 | 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | -- | -- |
| 重组小鼠IL-2 | -- | -- | |
| T细胞活化 | 抗CD3抗体 | Invitrogen | -- |
| 抗CD28抗体 | Invitrogen | -- | |
| 布雷菲德菌素A | BioLegend | -- | |
| 流式抗体 | PE-Ly-6G抗体 | -- | -- |
| BV421-CD45抗体 | -- | -- | |
| 质谱流式 | 194Pt单同位素顺铂 | Fluidigm | 201064 |
| FIX1缓冲液 | Fluidigm | 201065 | |
| 脂质组学 | 岛津Nexera 20-AD/ExionLC-AD液相色谱 | Shimadzu | -- |
| Sciex QTRAP 6500 PLUS质谱仪 | Sciex | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源：B16、MC38-OVA、B16-OVA；培养基：DMEM或RPMI 1640，10% FBS，1%青霉素/链霉素；培养条件：5% CO2，37°C。 阅读提示：STAR★Methods中的'Cell Culture'部分 |
| 动物模型 | 小鼠品系：C57BL/6J、Rag1-/-、NCG；年龄：6-8周；肿瘤细胞接种量：MC38-OVA 5×10^5，B16-OVA 5×10^4；基质胶：1:1混合；肿瘤体积计算公式：V=a^2b/2。 阅读提示：STAR★Methods中的'Animal Models'部分 |
| XBP1敲低/敲除 | shRNA靶向序列：shXbp1、shHmgcr；慢病毒感染；嘌呤霉素筛选浓度：10 μg/mL；IRE1α敲除使用CRISPR/Cas9；N-Smase敲除使用CRISPR/Cas9。 阅读提示：STAR★Methods中的'Lentiviral Infection'和'Generation of IRE1α and N-Smase knockout cell lines'部分 |
| 体内肿瘤生长评估 | 肿瘤接种后监测时间：如图1D、2M等所示；皮下注射方式：混有基质胶的PBS；生存分析：肿瘤体积超过1500 mm^3时处死。 阅读提示：STAR★Methods中的'Animal Models'部分及图例 |
| MDSC分析 | 肿瘤浸润白细胞分离方法：胶原酶I和DNase I消化；MDSC标记：CD11b+Ly6G+（MC38-OVA、B16-OVA）、Gr-1+（B16）；流式抗体及浓度需验证。 阅读提示：STAR★Methods中的'Flow Cytometry Analysis of Tumor-Infiltrating Immune Cells'部分 |
| 骨髓MDSC分化实验 | 骨髓细胞来源：C57BL/6J小鼠股骨；GM-CSF浓度：10 ng/mL培养3天；胆固醇处理：0.75 μg/mL处理3天；MβCD处理：5 mM处理24小时。 阅读提示：STAR★Methods中的'MDSC Differentiation Assay in vitro'部分 |
| sEV分离与处理 | 肿瘤细胞培养于EV-free和胆固醇-free FBS中，缺氧（1% O2）48小时；差速离心和超速离心条件：400 x g 10min，2000 x g 20min，15,000 x g 40min，120,000 x g 4h；sEV用量：2 μg（体外）；体内注射：10 μg（尾静脉）。 阅读提示：STAR★Methods中的'Isolation, characterization, labeling and treatment of Extracellular Vesicles'部分 |
| 药物处理 | 辛伐他汀：25 mg/kg腹腔注射，第7、9、11天；KIRA8：50 mg/kg腹腔注射，隔天一次；抗PD-1抗体：100 μg腹腔注射，第7、9天；GW4869：6 μg腹腔注射每天。 阅读提示：STAR★Methods中的'Animal Models'部分及图6 |