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        TDP43通过mtDNA-cGAS-STING轴增强NMOSD中的星形胶质细胞炎症活性

        TDP43 augments astrocyte inflammatory activity through mtDNA-cGAS-STING axis in NMOSD

        作者信息Zhuhe Liu, Yunmeng Bai, Bingtian Xu, Haixia Wen, Kechun Chen, Jingfang Lin, Yuanyuan Wang, Jiangping Xu, Haitao Wang, Fudong Shi, Jigang Wang, Honghao Wang
        PMID39844196
        期刊J Neuroinflammation
        发布时间2025-01-22
        DOI10.1186/s12974-025-03348-z
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        包含体外细胞模型、体内被动/主动免疫小鼠模型、患者样本ELISA、单核RNA测序及功能验证（敲低/过表达）和机制验证（cGAS/STING抑制剂），证据层级丰富。

        主要模型

        C57BL/6小鼠被动免疫NMOSD模型 C57BL/6小鼠主动免疫NMOSD模型 原代小鼠星形胶质细胞 人星形胶质细胞系SVG p12

        重点核对

        原代星形胶质细胞使用AQP4-IgG（40 µg/mL）和补体（2%）处理24小时 si-TDP43-3用于敲低TDP43，转染试剂为Lipofectamine RNAiMAX TDP43过表达使用TDP43质粒和Lipofectamine LTX转染12小时 体内敲低通过椎管内注射AAV-GfaABC1D-sh-TDP43（敲低序列GGUAUAUGUUGUCAACUAU）实现 cGAS抑制剂RU.521（10 mg/kg）和STING抑制剂H151（5 mg/kg）腹腔注射

        摘要

        反式激活反应区DNA结合蛋白43（TDP43）的异常被认为是神经退行性疾病的病理标志。然而，TDP43在视神经脊髓炎谱系疾病（NMOSD）中的作用仍不清楚。在此，我们的观察表明，在NMOSD的体外和体内模型以及NMOSD患者的生物样本中，TDP43表达上调。单核RNA测序显示，NMOSD诱导小鼠产生A1样反应性星形胶质细胞和星形胶质细胞线粒体功能障碍。我们进一步发现，NMOSD促使TDP43转位至线粒体并将线粒体DNA（mtDNA）释放到细胞质中。NMOSD导致mtDNA/环状GMP-AMP合酶（cGAS）/干扰素基因刺激因子（STING）通路激活和星形胶质细胞A1型炎症激活。至关重要的是，敲低TDP43显著改善了NMOSD诱导的星形胶质细胞线粒体功能障碍和cGAS/STING通路的激活。相反，TDP43的过表达加剧了这些病理变化。特异性沉默星形胶质细胞TDP43可改善NMOSD诱导的小鼠损伤，而TDP43过表达则加剧损伤。同时，cGAS和STING抑制剂均可减轻NMOSD诱导的小鼠损伤。总之，我们的数据表明，TDP43通过上调mtDNA/cGAS/STING信号通路加剧NMOSD中星形胶质细胞的炎症激活。因此，靶向TDP43代表了NMOSD的一种有吸引力的治疗策略。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        TDP43在NMOSD中是否通过影响星形胶质细胞线粒体功能障碍和cGAS/STING信号通路促进炎症激活？
        核心机制
        NMOSD诱导TDP43向线粒体转位，导致线粒体功能障碍和mtDNA释放，激活cGAS/STING通路，进而促进星形胶质细胞A1型炎症激活。
        主要证据
        体内外NMOSD模型中TDP43表达升高，敲低TDP43改善线粒体功能、抑制cGAS/STING通路及炎症，过表达TDP43则加重；患者CSF和血清中TDP43和cGAMP水平升高。
        研究意义
        靶向TDP43或mtDNA/cGAS/STING轴可能为NMOSD提供新的治疗策略。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        建立NMOSD模型并验证

        建立NMOSD的体外和体内模型，并验证其病理特征。

        利用AQP4-IgG和补体处理原代星形胶质细胞和SVG p12细胞；通过鞘内注射AQP4-IgG和补体建立被动免疫小鼠模型，通过皮下注射AQP4 p201-220肽乳剂建立主动免疫小鼠模型；通过行为学测试、western blot和免疫荧光验证模型。

        2

        检测星形胶质细胞TDP43表达和定位

        观察NMOSD中星形胶质细胞TDP43的表达水平和亚细胞定位变化。

        通过western blot和免疫荧光检测脊髓和培养细胞中TDP43的表达；通过分离细胞质和线粒体组分检测TDP43的转位。

        3

        单核RNA测序分析星形胶质细胞亚型

        揭示NMOSD中星形胶质细胞的转录组变化和亚型特征。

        对小鼠纹状体组织进行snRNA-seq，分析星形胶质细胞亚群，评估A1样和A2样反应性星形胶质细胞特征基因表达。

        4

        评估TDP43对星形胶质细胞功能的影响

        确定TDP43在NMOSD诱导的星形胶质细胞损伤中的作用。

        在细胞模型中敲低或过表达TDP43，检测线粒体膜电位、线粒体ROS、mtDNA释放、cGAS/STING通路蛋白表达及炎症因子水平。

        5

        体内验证TDP43的病理作用

        验证星形胶质细胞TDP43对NMOSD小鼠损伤的影响。

        通过椎管内注射AAV-sh-TDP43或AAV-TDP43敲低或过表达星形胶质细胞TDP43，建立NMOSD模型，评估行为学、病理和分子变化。

        6

        应用cGAS/STING抑制剂

        验证cGAS/STING通路在NMOSD病理中的必要性。

        在NMOSD小鼠模型中腹腔注射RU.521或H151，评估行为学、脱髓鞘和星形胶质细胞激活指标。

        7

        患者样本验证

        验证TDP43和cGAMP在NMOSD患者中的水平。

        收集NMOSD患者和对照的CSF和血清，用ELISA检测TDP43和cGAMP浓度，并分析其与EDSS评分的相关性。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        蛋白质印迹免疫荧光染色苏木精-伊红染色单核RNA测序
        验证细胞功能变化
        TMRE染色MitoSOX染色实时定量PCRF-actin染色
        验证分子表达变化
        酶联免疫吸附试验蛋白质印迹
        验证免疫效应
        行为学测试
        验证机制链路
        敲低和过表达药理学抑制
        评估体内效果
        体内小鼠模型行为学测试组织学染色
        数据分析与统计
        差异表达分析基因集富集分析t检验单因素方差分析

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        细胞培养与处理DMEM培养基----
        胎牛血清Thermo Fisher ScientificA3161001C
        AQP4抗体Thermo Fisher ScientificPA5-53234
        Western blotTDP43抗体Proteintech10782-2-AP
        cGAS抗体Proteintech26416-1-AP
        STING抗体Proteintech19851-1-AP
        免疫荧光STING抗体CST13647S
        细胞处理TDP43特异性siRNAGenePharma Technology--
        动物实验AAV-GFAP-TDP43Packgene Technology--
        AAV-GfaABC1D-sh-TDP43OBiO Technology--
        模型诱导AQP4 p201-220肽GL Biochem--
        蛋白提取RIPA裂解液FDBIO SCIENCEFD009
        Western blot5×双色蛋白上样缓冲液FDBIO SCIENCEFD006
        FDbio-Dura ECL试剂盒FDBIO SCIENCEFD8082
        山羊抗兔IgG (H+L)-HRPFDBIO SCIENCEFDR007
        蛋白酶抑制剂混合物CWBIOCW2200S
        磷酸酶抑制剂混合物CWBIOCW2383S
        RNA提取与RT-PCRRNA快速提取试剂盒（组织/细胞）TIANGEN BiotechDP451
        RT-PCRFastKing gDNA去除RT SuperMixTIANGEN BiotechKR118
        DNA提取细胞/组织基因组DNA提取试剂盒TIANGEN BiotechDP304
        RT-PCRFastReal qPCR预混液（SYBR Green）TIANGEN BiotechFP217
        核质分离核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒Beyotime BiotechP0027
        模型诱导人补体Sigma-AldrichS1764
        药物处理RU.521SelleckS6841
        H151SelleckS6652
        ELISA人TDP43 ELISA试剂盒SAB BiotechEK16829-96T
        人2'3'-cGAMP ELISA试剂盒MEIMIAN BiotechMM-60017H1
        模型诱导完全弗氏佐剂Chondrex7027
        百日咳毒素GLPBIOGC17532
        细胞转染Lipofectamine RNAiMAX转染试剂Thermo Fisher Scientific13778150
        Lipofectamine LTX转染试剂Thermo Fisher Scientific15338100
        线粒体功能检测四甲基罗丹明乙酯高氯酸盐（TMRE）Thermo Fisher ScientificT669
        MitoSOXThermo Fisher ScientificM36008
        F-actin染色Alexa Fluor 488 鬼笔环肽Thermo Fisher ScientificA12379
        线粒体分离细胞线粒体分离试剂盒Thermo Fisher Scientific89874
        ELISAIL-6检测试剂盒ProteintechKE10007
        IL-1β检测试剂盒ProteintechKE10002
        TNF-α检测试剂盒ProteintechKE10003
        免疫荧光含DAPI封片剂Abcamab104139
        TDP43抗体Abcamab104223
        Tomm20抗体Abcamab186735
        GFAP抗体Thermo Fisher ScientificMA5-12023
        Iba1抗体Thermo Fisher ScientificMA5-27726
        C3/C3b/C3c抗体Proteintech21337-1-AP
        Western blotp-TDP43抗体 (Ser409/410)Proteintech22309-1-AP
        髓鞘碱性蛋白（MBP）抗体Proteintech10458-1-AP
        iNOS抗体Proteintech22226-1-AP
        S100A10抗体Proteintech11250-1-AP
        TFAM抗体Proteintech22586-1-AP
        GAPDH抗体Proteintech60004-1-Ig
        组蛋白H3抗体CST4499
        山羊抗小鼠IgG (H+L)-HRPFDBIO SCIENCEFDM007
        免疫荧光山羊抗小鼠IgG Dylight 549Abbkine ScientificA23310
        山羊抗兔IgG Dylight 549Abbkine ScientificA23320
        山羊抗小鼠IgG Dylight 488Abbkine ScientificA23210
        山羊抗兔IgG Dylight 488Abbkine ScientificA23220
        山羊抗兔IgG Dylight 649Abbkine ScientificA23630
        细胞培养Opti-MEM低血清培养基Thermo Fisher Scientific31985070
        活细胞成像溶液Thermo Fisher ScientificA14291DJ
        抗体纯化Melon凝胶IgG旋转纯化试剂盒Thermo Fisher Scientific45206
        蛋白定量Pierce快速金BCA蛋白定量试剂盒Thermo Fisher ScientificA53225

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        细胞培养与处理
        原代星形胶质细胞分离培养条件；AQP4-IgG和补体浓度（40 µg/mL和2%）及处理时间（24小时）
        阅读提示：Methods中“Cell culture and treatment”
        敲低和过表达
        siRNA序列和转染试剂（RNAiMAX）；TDP43质粒和转染试剂（LTX）；转染时长
        阅读提示：Methods中“Knockdown of TDP43 in primary astrocytes and SVG p12 cells”和“Overexpression of TDP43 in primary astrocytes and SVG p12 cells”
        动物模型建立
        小鼠品系、年龄、性别；被动模型注射剂量和频率；主动模型免疫剂量和佐剂
        阅读提示：Methods中“The induction of the passive and active immunization NMOSD mouse models”
        药物处理
        RU.521和H151的剂量（10 mg/kg和5 mg/kg）及给药途径（腹腔注射）
        阅读提示：Methods中“Drug administration”
        分子检测
        western blot一抗稀释比例（文中未明确说明）；TMRE和MitoSOX浓度及孵育时间；RT-PCR引物序列
        阅读提示：Methods中“Western blot”、“TMRE staining”、“MitoSOX staining”和“Real-time quantitative PCR”

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