UCB刺激的细胞模型和BE动物模型建立
模拟新生儿高胆红素血症条件，观察UCB对星形胶质细胞和脑组织的代谢及表观遗传影响。
体外用50 µmol/L UCB和100 µmol/L人血清白蛋白处理原代星形胶质细胞；体内通过小脑延髓池注射胆红素（10 µg/g）建立BE大鼠模型。检测乳酸水平和H3K18la水平。
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H3K18乳酸化介导的核苷酸结合寡聚化结构域2（NOD2）表达促进胆红素诱导的星形胶质细胞焦亡
H3K18 lactylation-mediated nucleotide-binding oligomerization domain-2 (NOD2) expression promotes bilirubin-induced pyroptosis of astrocytes
实验完整度
高包含原代星形胶质细胞体外模型和BE大鼠体内模型，结合CUT&Tag、RNA-seq、Western blot、ELISA、免疫荧光、行为学等多种方法，并进行了基因敲低/过表达功能验证和机制研究。
主要模型
原代星形胶质细胞 新生SD大鼠胆红素脑病（BE）模型
重点核对
原代星形胶质细胞纯度>95%（GFAP染色） UCB处理浓度50 µmol/L，伴100 µmol/L人血清白蛋白 BE模型：新生3天大鼠小脑延髓池注射10 µg/g胆红素 OX（糖酵解抑制剂）剂量：体外2.5 mM/L，体内0.5 g/kg腹腔注射 NOD2抑制剂GSK717剂量：10 g/kg（原文如此，可能为mg/kg，需核对）
摘要
组蛋白乳酸化是一种新发现的与糖酵解相关的组蛋白修饰，在多种免疫细胞的基因表达调控中发挥关键作用。然而，组蛋白乳酸化在星形胶质细胞中的作用仍不清楚。本研究表明，在未结合胆红素（UCB）刺激的原代星形胶质细胞和胆红素脑病（BE）大鼠的海马中，H3K18乳酸化（H3K18la）水平上调。抑制糖酵解可降低H3K18la水平，并在体内外减轻焦亡。CUT&Tag和RNA-seq结果显示，H3K18la富集于核苷酸结合寡聚化结构域2（NOD2）的启动子区域并促进其转录。此外，NOD2增强了下游丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子-κB（NF-κB）信号通路的激活，加剧了BE的神经炎症。总之，本研究提供了星形胶质细胞表观遗传调控的新认识，中断H3K18la/NOD2轴可能代表治疗胆红素脑病的新策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- H3K18la是否参与UCB诱导的星形胶质细胞焦亡及其下游调控机制。
- 核心机制
- UCB刺激引起星形胶质细胞糖酵解增强、乳酸蓄积，导致H3K18la水平升高，H3K18la富集于NOD2启动子促进其转录，NOD2激活MAPK（JNK、ERK、p38）和NF-κB（p65）通路，加剧细胞焦亡和神经炎症。
- 主要证据
- 体外原代星形胶质细胞和体内BE大鼠模型，通过LDHA敲低、NOD2敲低/过表达、药理学抑制（OX、GSK717）结合Western blot、ELISA、免疫荧光等验证，证明H3K18la/NOD2轴通过MAPK/NF-κB通路促进焦亡。
- 研究意义
- 研究为星形胶质细胞的代谢-表观遗传调控提供新见解，抑制星形胶质细胞糖酵解可能成为治疗神经炎症相关疾病（如胆红素脑病）的潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
抑制H3K18la对焦亡的影响
验证H3K18la是否调控UCB诱导的星形胶质细胞焦亡。
使用糖酵解抑制剂OX或LDHA敲低抑制H3K18la，观察焦亡相关蛋白（Caspase-1 p20、GSDMD-N、NLRP3）和IL-1β的变化。
CUT&Tag和RNA-seq筛选H3K18la靶基因
鉴定H3K18la调控的下游靶基因。
对UCB处理的星形胶质细胞进行CUT&Tag和RNA-seq，结合LDHA敲低后转录组变化，筛选出NOD2作为候选靶基因。
验证H3K18la对NOD2表达的调控
证实H3K18la直接促进NOD2转录。
通过CUT&Tag-qPCR、RT-qPCR和Western blot检测NOD2启动子上的H3K18la富集和NOD2表达水平，并在LDHA敲低后检测变化。
NOD2功能验证及其下游通路
验证NOD2在UCB诱导的焦亡中的作用及下游信号通路。
敲低或过表达NOD2，观察焦亡表型；并检测MAPK和NF-κB通路相关蛋白磷酸化水平。
体内验证H3K18la/NOD2轴的作用
在BE大鼠模型中验证H3K18la/NOD2轴对焦亡和神经功能的影响。
使用OX抑制H3K18la，GSK717抑制NOD2，检测海马组织中焦亡相关蛋白和MAPK/NF-κB通路变化，并进行H&E染色和Morris水迷宫行为学测试。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 胰蛋白酶 | Sigma-Aldrich | -- |
| 脱氧核糖核酸酶I | Sigma-Aldrich | -- | |
| DMEM培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | ExCell | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 胆红素粉末 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 人血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 代谢分析 | Seahorse XFe96细胞外通量分析仪 | Agilent | -- |
| Seahorse XF糖酵解速率检测试剂盒 | Agilent | -- | |
| 乳酸检测 | 乳酸检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime Biotechnology | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| H3K18la抗体 | PTM BIO | PTM1406RM | |
| NLRP3抗体 | Novus | NBP2-12446 | |
| Caspase-1 p20抗体 | proteintech | 22915-1-AP | |
| GSDMD-N抗体 | Abcam | ab219800 | |
| 组蛋白H3抗体 | CST | 9715S | |
| β-actin抗体 | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| RIK2抗体 | proteintech | 15366-1-AP | |
| p-p65抗体 | proteintech | 82335-1-RR | |
| JNK抗体 | zenbio | R24780 | |
| p-JNK抗体 | zenbio | R381100 | |
| p38抗体 | proteintech | 14064-1-AP | |
| p-p38抗体 | proteintech | 28796-1-AP | |
| ERK抗体 | proteintech | 11257-1-AP | |
| p-ERK抗体 | proteintech | 28733-1-AP | |
| α-tubulin抗体 | HUABIO | ER130905 | |
| NOD2抗体 | SAB | 54121 | |
| 辣根过氧化物酶标记二抗 | ZSGB-Bio | ZB-2305/ZB-2301 | |
| Bio-Rad ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | APExBIO | -- |
| 免疫荧光 | GFAP抗体 | ThermoFisher | 13-0300 |
| A1R共聚焦激光扫描显微镜 | Nikon | -- | |
| ELISA | IL-1β ELISA试剂盒 | 4 A Biotec | -- |
| RNA提取 | SteadyPure RNA提取试剂盒 | Accurate Biology | -- |
| 逆转录 | PrimeScript RT试剂盒 | Takara | -- |
| qPCR | QuantiNova SYBR Green PCR试剂 | Qiagen | -- |
| Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR检测系统 | Bio-Rad | -- | |
| RNA-seq | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Scientific | -- | |
| 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| VAHTS Universal V6 RNA-seq文库制备试剂盒 | -- | -- | |
| Illumina Novaseq 6000测序平台 | Illumina | -- | |
| CUT&Tag | Hyperactive™ In-Situ ChIP文库制备试剂盒 | Vazyme Biotech | -- |
| 细胞转染 | CALNP RNAi体外转染试剂 | D-Nano Therapeutics | -- |
| 线性聚乙烯亚胺 | APExBIO | -- | |
| 质粒提取 | TIANprep快速小提质粒试剂盒 | TIANGEN | -- |
| 动物麻醉 | 异氟烷 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和处理 | 原代星形胶质细胞纯度（>95% GFAP阳性）、UCB浓度（50 µmol/L）、HSA浓度（100 µmol/L）、处理时间（0-24h） 阅读提示：Materials and methods: Primary astrocytes culture and treatment |
| BE模型建立 | SD大鼠年龄（3天）、胆红素剂量（10 µg/g）、注射途径（小脑延髓池）、对照溶液配制 阅读提示：Materials and methods: BE model establishment and treatment |
| 抑制H3K18la | OX剂量（体外2.5 mM/L，体内0.5 g/kg）、si-LDHA序列及转染条件、乳酸钠剂量 阅读提示：Materials and methods: Si-RNAs and plasmids transfection, Figure S1-S3 |
| CUT&Tag和RNA-seq | 抗体（H3K18la）、试剂盒（Hyperactive In-Situ ChIP Library Prep Kit）、测序平台（Illumina Novaseq6000）、数据分析软件参数 阅读提示：Materials and methods: CUT&Tag assays and CUT&Tag qPCR, RNA extraction, library construction, and illumina sequencing |
| 体内药物干预 | OX给药时间（UCB前6h）、GSK717给药剂量（10 g/kg，原文如此）、给药途径（腹腔注射） 阅读提示：Materials and methods: BE model establishment and treatment |