EAE模型建立
建立模拟MS病理特征的小鼠模型以研究ZNRF1的作用
对8-12周龄小鼠皮下注射MOG35-55/CFA乳剂，并在第0、2、7天腹腔注射百日咳毒素，随后监测临床评分和体重变化。
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髓系ZNRF1通过调控MHC-II介导的T细胞活化抑制自身免疫性脱髓鞘和神经炎症
Myeloid ZNRF1 suppresses autoimmune demyelination and neuroinflammation by regulating MHC-II-mediated T cell activation
实验完整度
高包含系统性、髓系特异性及小胶质细胞特异性ZNRF1敲除小鼠的EAE模型，结合流式、组化、免疫印迹及体外共培养等功能与机制验证。
主要模型
MOG35-55诱导的EAE小鼠模型 Znrf1系统性敲除小鼠 髓系特异性Znrf1敲除小鼠(Znrf1Δmye) 小胶质细胞特异性Znrf1敲除小鼠(Znrf1Δglia)
重点核对
ZNRF1在髓系细胞中的表达及EAE进展中的表型差异 EAE诱导后脾脏巨噬细胞表面MHC-II表达水平 2D2 TCR转基因CD4+ T细胞与CD11b+髓系细胞共培养的增殖情况 EAE模型中Th1和Th17细胞的极化
摘要
多发性硬化症(MS)是一种自身免疫性和神经炎症性疾病，以轴突损伤、炎性脱髓鞘和神经变性为特征。然而，MS发病的确切机制仍不清楚。在此，我们确定E3泛素连接酶ZNRF1是实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的关键调节因子，EAE是一种再现MS自身免疫性脱髓鞘特征的小鼠模型。缺乏ZNRF1的小鼠对EAE进展的易感性增加。值得注意的是，外周髓系细胞而非小胶质细胞中ZNRF1的缺失导致中枢神经系统免疫细胞浸润增强，导致脱髓鞘和疾病严重程度加剧。Znrf1缺陷小鼠EAE严重程度的增加与Th1和Th17细胞极化增加、抗原特异性T辅助细胞增殖升高以及免疫反应增强有关。此外，在EAE诱导后，来自Znrf1缺陷小鼠的巨噬细胞表现出MHC-II类分子表面表达升高。总之，我们的研究结果表明，外周髓系细胞中的ZNRF1通过调节MHC-II表面表达，从而控制抗原特异性T细胞增殖和活化，在神经炎症中发挥抑制作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ZNRF1是否通过调节免疫细胞功能影响多发性硬化症相关的神经炎症？
- 核心机制
- 外周髓系细胞中的ZNRF1通过维持巨噬细胞表面MHC-II的稳态表达，抑制抗原特异性CD4+ T细胞的增殖和活化，从而减轻自身免疫性神经炎症。
- 主要证据
- 髓系特异性ZNRF1敲除小鼠EAE加重，伴随Th1/Th17细胞增多及CNS免疫浸润增强；ZNRF1缺陷巨噬细胞表面MHC-II上调，且体外共培养显示其增强MOG特异性T细胞增殖。
- 研究意义
- ZNRF1被鉴定为MS的潜在生物标志物和治疗靶点，为调节神经炎症性疾病中的髓系细胞功能提供了新方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CNS浸润免疫细胞分析
评估ZNRF1缺失对CNS免疫细胞浸润和病变的影响
在EAE发病高峰期和慢性期分离脊髓和脑组织，通过流式细胞术和免疫组化分析浸润的免疫细胞类型和数量，并通过LFB染色评估脱髓鞘程度。
外周淋巴器官T细胞活化与分化分析
探究ZNRF1缺失对T细胞初始活化和分化的影响
在EAE诱导后不同时间点收集脾脏和引流淋巴结，通过流式细胞术分析naïve、中心记忆、效应记忆CD4+和CD8+ T细胞亚群，以及Th1、Th17和细胞毒性T细胞的比例。
抗原特异性T细胞增殖实验
验证ZNRF1缺陷的髓系细胞能否增强抗原特异性T细胞反应
将CFSE标记的2D2 TCR转基因CD4+ T细胞与免疫后小鼠脾脏来源的CD11b+髓系细胞共培养，在有无MOG35-55刺激下检测T细胞增殖和活化。
髓系细胞表面分子表达分析
确定ZNRF1调控T细胞活化的分子机制
通过流式细胞术分析脾脏中不同髓系细胞亚群表面MHC-I、MHC-II、CD40、CD80/86、PD-L1和FasL的表达，并比较总MHC-II与表面MHC-II水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
动物模型构建
分子表达检测
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| EAE诱导 | MOG35-55 | GeneScript | SC1208 |
| 弗氏完全佐剂 | BD/DIFICO | 263810 | |
| 百日咳毒素 | List Biological Laboratories | 180 | |
| CNS浸润细胞分离 | 胶原酶/分散酶 | Roche | 10269638001 |
| 脱氧核糖核酸酶I | Roche | 10104159001 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17089101 | |
| 免疫组织化学 | 抗CD3抗体 | Ventana Medical Systems | 790-4341 |
| 抗CD68抗体 | Abcam | ab125212 | |
| 抗IFNγ抗体 | Bioss | BS-0480R | |
| 抗IL-17A抗体 | Bioss | BS-1183R | |
| Ultraview DAB检测试剂盒 | Ventana Medical Systems | -- | |
| TissueFAXS显微镜 | TissueGnostics | -- | |
| 脾细胞分离 | 红细胞裂解液 | -- | -- |
| 死细胞去除试剂盒 | MACS | 130-090-101 | |
| MS分离柱 | MACS | 130-042-201 | |
| 流式细胞术 | 可固定活力染料780 | BD Biosciences | 565388 |
| Zombie NIR染料 | Biolegend | 423106 | |
| 纯化抗小鼠CD16/32抗体 | Biolegend | 101302 | |
| 佛波醇-12-豆蔻酸酯-13-乙酸酯 | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| 离子霉素 | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| 布雷菲德菌素A | Biolegend | -- | |
| Cytofix/Cytoperm固定/破膜试剂盒 | BD Biosciences | 554714 | |
| Cytek Aurora流式细胞仪 | Cytek | -- | |
| Cytek Northern Lights流式细胞仪 | Cytek | -- | |
| BD LSR II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| BD FACSLyric流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| FlowJo软件 | BD Biosciences | -- | |
| 增殖实验 | 羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 | eBioscience | 65-0850-84 |
| 脊髓组织标记与成像 | 小麦胚芽凝集素-Alexa Fluor 488偶联物 | Invitrogen | W11261 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 兔抗Lyve-1抗体 | Abcam | ab14917 | |
| Alexa Fluor 647偶联抗小鼠CD3抗体 | Biolegend | 100209 | |
| Alexa Fluor 546偶联山羊抗兔IgG二抗 | Thermo | A11010 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| RapiClear 1.52溶液 | SunJin Lab | -- | |
| LSM800共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | -- | |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Sigma-Aldrich | -- | |
| PVDF膜 | Merck Millipore | -- | |
| ECL Western blot底物 | -- | -- | |
| 流式细胞术 | CD4-BV711抗体 | BD Pharmingen | 563726 |
| IL-17A-BV421抗体 | BD Pharmingen | 563354 | |
| H-2 Kb/H-2Db-BV480抗体 | BD Pharmingen | 746258 | |
| RORγt-PE抗体 | BD Pharmingen | 562607 | |
| Brilliant Stain缓冲液Plus | BD Pharmingen | 566385 | |
| CD80-PE-Cy7抗体 | Cytek Biosciences | 60-0801 | |
| Ly-6G-violetFluor 450抗体 | Cytek Biosciences | 75-1276 | |
| CD11b-PE-Cy7抗体 | Biolegend | 101216 | |
| CD11b-BV510抗体 | Biolegend | 101263 | |
| CD11c-APC抗体 | Biolegend | 117310 | |
| CD11c-PE抗体 | Biolegend | 117308 | |
| CD172a-PE-Dazzle 594抗体 | Biolegend | 144016 | |
| CD178 (FasL)-PE抗体 | Biolegend | 106605 | |
| CD19-PE抗体 | Biolegend | 152407 | |
| CD25-BV421抗体 | Biolegend | 102043 | |
| CD274 (B7-H1, PD-L1)-BV421抗体 | Biolegend | 124315 | |
| CD3-APC抗体 | Biolegend | 100322 | |
| CD3-PE抗体 | Biolegend | 100205 | |
| CD45-FITC抗体 | Biolegend | 103108 | |
| CD40-APC/Cyanine7抗体 | Biolegend | 124638 | |
| CD45-BV421抗体 | Biolegend | 103147 | |
| CD45-PerCP-Cy5.5抗体 | Biolegend | 103132 | |
| CD45R/B220-FITC抗体 | Biolegend | 103206 | |
| CD45R/B220-Alexa Fluor 700抗体 | Biolegend | 103232 | |
| CD62L-BV605抗体 | Biolegend | 104438 | |
| CD69-PE抗体 | Biolegend | 104507 | |
| CD8a-PE抗体 | Biolegend | 100708 | |
| CD86-PE/Cy5抗体 | Biolegend | 105015 | |
| Gr1 (Ly-6G/Ly-6C)-PE抗体 | Biolegend | 108407 | |
| F4/80-BV711抗体 | Biolegend | 123147 | |
| I-A/I-E (MHC-II)-BV605抗体 | Biolegend | 107639 | |
| IFN-γ-APC抗体 | Biolegend | 505810 | |
| Ly-6C-FITC抗体 | Biolegend | 128006 | |
| T-bet-BV605抗体 | Biolegend | 644817 | |
| XCR1-BV785抗体 | Biolegend | 148225 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| EAE模型建立 | MOG35-55佐剂乳剂的制备方法、皮下注射部位及体积、百日咳毒素的给药方案、小鼠周龄和性别 阅读提示：Materials and methods中的Establishment of the EAE model |
| CNS浸润细胞分离 | 灌注液体积、酶消化浓度和时间、Percoll梯度离心参数 阅读提示：Materials and methods中的Isolation of CNS-infiltrating cells |
| 流式细胞术 | 抗体克隆号、荧光素、稀释比例、染色顺序和固定破膜条件 阅读提示：Materials and methods中的Flow cytometry: staining and analysis |
| 增殖实验 | CD11b+细胞分离时间点、CD4+ T细胞与CD11b+细胞共培养比例、MOG35-55浓度、共培养时间 阅读提示：Materials and methods中的Proliferation Assay及图5图例 |
| 髓系细胞表面分子分析 | 巨噬细胞等亚群的定义门控策略、表面与总MHC-II染色的区分方法 阅读提示：Materials and methods中的Flow cytometry: staining and analysis及图6图例 |