生成S1PR3GRE-/GRE-大鼠
删除S1PR3基因上游的GRE，以研究该位点对S1PR3表达及应激反应的影响。
使用CRISPR/Cas9技术在大鼠受精卵中显微注射gRNA和Cas9，删除染色体17上1445 bp的序列，该序列包含假定的GRE。通过PCR和基因分型确认基因型。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
一个糖皮质激素反应元件以性别特异性方式调节社交性
A single glucocorticoid response element regulates sociability in a sex-specific manner
实验完整度
高包含基因编辑动物模型、细胞电生理记录、行为学、免疫组化、血液学及化学遗传学等多层级验证，并进行功能与机制验证。
主要模型
S1PR3GRE-/GRE-大鼠 野生型同窝大鼠 社交失败应激模型 蓝斑-内侧前额叶皮层神经环路
重点核对
大鼠基因型（S1PR3GRE-/GRE-与野生型）及性别 社交失败应激天数（7天）和每日时长（30分钟） CNO给药剂量（2 mg/kg，腹腔注射）及其时间（失败前60分钟） 病毒注射（CAV2-Cre和AAV9-hSyn-DIO-hM4D-mCherry）的目标脑区（LC和mPFC）及坐标 行为检测（社交互动时间）和电生理记录（LC-mPFC一致性）的时间点
摘要
糖皮质激素受体（GRs）调节转录以减少炎症过程，调节神经元功能，并影响行为。然而，GRs结合的对这些效应至关重要的精确基因座尚未完全确定。在这里，我们使用CRISPR/Cas9方法在大鼠中删除了1-磷酸鞘氨醇受体3（S1PR3）基因附近的GR结合位点（S1PR3GRE-/GRE-大鼠）。社交失败后的S1PR3GRE-/GRE-雄性表现出炎症标志物增加和社交性降低，与失败的野生型（WT）对照相比。在无应激的雌性中也观察到类似效应，表明雌性对GR调节S1PR3的依赖性更强。失败的S1PR3GRE-/GRE-雄性蓝斑（LC）和内侧前额叶皮层（mPFC）之间的神经活动一致性增加，而无应激的S1PR3GRE-/GRE-雌性也观察到增加。在失败期间化学遗传学抑制投射到mPFC的LC神经元增加了WT和S1PR3GRE-/GRE-雄性随后的社交互动。总之，这些发现表明GR诱导的S1PR3通过降低LC和mPFC之间的神经活动一致性来减轻炎症过程并促进恢复力，并且可能是减轻女性应激影响的重要机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- GR结合位点（GRE）对S1PR3表达的调控是否影响应激诱导的炎症、神经环路活动和社交行为，以及这种影响是否存在性别差异？
- 核心机制
- 皮质酮激活GR，通过结合S1PR3基因上游的GRE增加S1PR3表达，进而减轻炎症、降低LC-mPFC神经活动一致性，从而促进社交性并增强应激恢复力。
- 主要证据
- S1PR3GRE-/GRE-大鼠中S1PR3表达降低，失败雄性及无应激雌性出现炎症标志物增加、LC-mPFC一致性增强和社交互动减少；化学遗传学抑制mPFC投射的LC神经元可减轻这些效应并恢复社交性。
- 研究意义
- 本研究鉴定了一个新的基因组位点，该位点通过减轻应激诱导的LC-mPFC一致性来减轻炎症并促进应激恢复力，为理解应激相关疾病的性别差异提供了机制基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证S1PR3表达及GR结合
确认GR结合GRE并对S1PR3表达的影响。
通过染色质免疫沉淀（ChIP）检测GR在GRE位点的结合；通过免疫组化检测mPFC中S1PR3蛋白水平；通过qRT-PCR检测全血中S1PR3 mRNA水平。
社交失败应激模型及行为学测试
评估S1PR3GRE-/GRE-大鼠在应激条件下的社交行为和应对策略。
对雄性、雌性大鼠进行7天社交失败应激或对照处理，记录失败潜伏期，随后进行社交互动测试。
炎症指标检测
评估GR-induced S1PR3对应激诱导炎症的影响。
通过免疫组化检测IBA1+细胞密度（小胶质细胞）；收集血液进行血细胞计数，分析单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞浓度及中性粒细胞/淋巴细胞比率。
神经电生理记录及化学遗传学操作
评估LC-mPFC神经活动一致性在应激中的作用，并验证抑制mPFC投射的LC神经元能否改善社交行为。
在WT和S1PR3GRE-/GRE-大鼠的LC和mPFC植入电极，记录局部场电位（LFP）并计算相干性。在部分大鼠中，通过注射CAV2-Cre和AAV9-hSyn-DIO-hM4D-mCherry在LC表达hM4D，并用CNO抑制神经元活动。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| CRISPR/Cas9基因编辑 | Cas9 | -- | -- |
| 染色质免疫沉淀 | 染色质免疫沉淀试剂盒 | EMD Millipore | 17-295 |
| 兔抗GR单克隆抗体 | Cell Signaling | D6H2L, | |
| 蛋白A磁珠 | -- | -- | |
| NanoDrop 2000分光光度计 | -- | -- | |
| 免疫组织化学 | 兔抗S1PR3/Edg3抗体 | BIOSS | bs-7541R |
| 兔抗IBA1抗体 | Wako | 019-19741 | |
| 兔抗mCherry抗体 | Abcam | ab167453 | |
| 驴抗兔Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150073 | |
| 驴抗兔Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150076 | |
| 生物素化驴抗兔抗体 | Jackson Laboratories | 711-065-152 | |
| 亲和素-生物素复合物（Vectastain） | -- | -- | |
| DAB显色液 | Sigma | -- | |
| 立体定向病毒注射 | AAV9-hSyn-DIO-hM4D-HA-mCherry | University of North Carolina Vector Core | -- |
| AAV9-hSyn-DIO-HA-mCherry | University of North Carolina Vector Core | -- | |
| CAV2-Cre | Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier | -- | |
| 电生理记录 | 定制记录电极 | MicroProbes | PI(7mm)0030.1B10 |
| 血细胞分析 | Sysmex XT自动血液分析仪 | Sysmex | -- |
| 血液收集 | RNAprotect动物血液管 | Qiagen | 76554 |
| 血液mRNA提取 | RNeasy Protect动物血液RNA提取试剂盒 | Qiagen | 73224 |
| qRT-PCR | 高效cDNA反转录试剂盒 | Thermo Fischer Scientific | 4368814 |
| SYBR Green荧光染料 | -- | -- | |
| ABI 7500 PCR仪 | Applied Biosystems | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 基因编辑鼠生成 | gRNA序列、删除的DNA片段长度和位置（染色体17: 13738152-13739596）、F4代使用 阅读提示：Methods中‘Generation of S1PR3GRE-/GRE- rats’ |
| 社交失败应激 | 社交失败天数（7天）、每天时长（30分钟）、失败潜伏期定义（雄性）、雌性攻击者条件（哺乳期雌鼠、幼崽日龄）、攻击次数上限（雌性5次） 阅读提示：Methods中‘Resident-intruder model of social defeat’ |
| 分子表达检测 | S1PR3抗体（BIOSS bs-7541R）、IBA1抗体（Wako 019-19741）、mCherry抗体（Abcam ab167453）、染色条件（一抗浓度、二抗浓度、DAB显色） 阅读提示：Methods中‘Immunohistochemistry’ |
| 化学遗传学操作 | 病毒注射坐标（LC: Lambda -3.7, D/V 5.1 mm, M/L ±1.4 mm; mPFC: Bregma +3.2 mm, D/V 4.4 mm, M/L ±0.5 mm）、注射体积（LC 500 nL, mPFC 1 µL）、CNO剂量（2 mg/kg，腹腔注射） 阅读提示：Methods中‘Stereotaxic virus injections’和‘Local field potential recordings’ |
| 电生理记录 | 电极植入位置（mPFC: Bregma +3.2 mm, D/V 4.4 mm, M/L 0.5 mm; LC: Lambda -3.7 mm, D/V 5.1 mm, M/L 1.4 mm）、记录时长（10分钟基线、10分钟失败后）、频率范围（delta, theta, alpha, beta, gamma等） 阅读提示：Methods中‘Local field potential recordings’ |
| 行为测试 | 社交互动测试箱大小（70 cm × 70 cm）、互动时间定义（鼻尖距离小于3 cm）、测试时长（15分钟）、刺激鼠匹配条件（同性别、同品系、相近大小） 阅读提示：Methods中‘Social interaction’ |