DOEC和EVs的分离与鉴定
获得并验证梅花鹿输卵管上皮细胞及其分泌的细胞外囊泡。
从屠宰场获取鹿输卵管，分离输卵管上皮细胞进行培养，通过CK18免疫荧光鉴定细胞。收集条件培养基，通过超速离心提取EVs，并通过NTA、TEM和Western blot鉴定EVs的特征。
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梅花鹿输卵管上皮细胞来源的细胞外囊泡对卵母细胞和孤雌胚胎的影响
The effects of sika deer oviduct epithelial cell-derived extracellular vesicles on oocytes and parthenogenetic embryos†
实验完整度
高包含细胞培养、EV分离鉴定、体外卵母细胞成熟、卵丘细胞功能检测、胚培养等，并进行多维度机制验证。
主要模型
梅花鹿卵丘-卵母细胞复合体（COC） 梅花鹿卵丘细胞（CC） 梅花鹿孤雌胚胎
重点核对
DOEC-EVs的最佳浓度（1×10^7个/mL） 体外成熟培养时间（28小时） 培养温度（38.5°C）和CO2浓度（5%） DOEC-EVs与CCs共培养时，EVs被CCs摄取而非卵母细胞
摘要
输卵管含有多种营养物质，在卵母细胞发育过程中提供能量。本研究旨在利用梅花鹿（Cervus nippon）输卵管上皮细胞产生的细胞外囊泡（EVs）提高体外繁殖的效率。令人惊讶的是，被致密卵丘细胞（CCs）包裹的卵丘-卵母细胞复合体对鹿输卵管上皮细胞细胞外囊泡（DOEC-EVs）的摄取仅发生在成熟过程中的CCs中。因此，我们假设DOEC-EVs通过CCs转运至卵母细胞以发挥其作用。我们首先研究了DOEC-EVs对卵丘-卵母细胞复合体扩张能力的影响，以及对CCs中细胞周期进程、增殖、凋亡、乳酸和丙酮酸水平的影响，并检测了活性氧水平、线粒体功能和关键基因表达。结果表明，DOEC-EVs调节细胞周期进程，促进增殖，减少凋亡，提高抗氧化能力和糖酵解，并通过卵母细胞第一极体排出率、活性氧水平和线粒体膜电位表明，CCs促进了卵母细胞的体外成熟，改善了卵母细胞的抗氧化能力和线粒体功能，并促进了孤雌胚胎的发育。这些结果表明，DOEC-EVs通过作用于CCs提高了鹿卵母细胞体外发育的效率，为鹿体外繁殖的进一步研究奠定了基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- DOEC-EVs是否通过影响卵丘细胞的功能来促进梅花鹿卵母细胞的体外成熟和孤雌胚胎发育。
- 核心机制
- DOEC-EVs通过被卵丘细胞摄取，调节卵丘细胞周期、促进增殖、抑制凋亡、增强抗氧化能力和糖酵解，并通过间隙连接加强卵丘细胞与卵母细胞的通讯，从而改善卵母细胞质量。
- 主要证据
- 体外实验显示，DOEC-EVs处理提高了卵丘细胞扩增相关基因（PTGS2, PTX3, HAS2）的表达，上调了间隙连接蛋白CX37/CX43的表达，减少了活性氧，提高了线粒体膜电位和ATP含量，促进了糖酵解，并最终提高了卵母细胞成熟率和第一极体排出率，以及孤雌胚胎的卵裂率和囊胚率。
- 研究意义
- 研究表明DOEC-EVs通过作用于卵丘细胞提高梅花鹿卵母细胞体外发育效率，为鹿的体外繁殖研究奠定了基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
DOEC-EVs摄取实验
验证DOEC-EVs是否被卵丘-卵母细胞复合体摄取。
用红色荧光染料标记EVs，将其添加到COCs培养液中，培养28小时后通过共聚焦显微镜观察荧光信号。
DOEC-EVs对卵丘细胞增殖、凋亡和周期的影响
研究DOEC-EVs对卵丘细胞生理功能的影响。
不同浓度EVs处理CCs 48小时，用CCK-8检测增殖活性；用EdU染色检测增殖；用流式细胞术检测细胞周期和凋亡；用RT-qPCR检测细胞周期和凋亡相关基因表达，并用Western blot验证凋亡蛋白caspase-9表达。
DOEC-EVs对卵丘细胞氧化应激和线粒体功能的影响
评估DOEC-EVs对卵丘细胞抗氧化能力和线粒体功能的影响。
检测ROS和GSH水平，通过荧光显微镜观察；用JC-1染色检测线粒体膜电位；检测ATP含量；通过免疫荧光检测TOM20蛋白表达；通过RT-qPCR检测抗氧化和线粒体相关基因表达。
DOEC-EVs对卵丘细胞糖酵解的影响
研究DOEC-EVs是否影响卵丘细胞的糖酵解活性。
分别单独培养CCs或与卵母细胞共培养，并添加DOEC-EVs，检测培养液中丙酮酸和乳酸含量，并通过RT-qPCR检测糖酵解相关基因表达。
DOEC-EVs对卵母细胞质量的影响
评估DOEC-EVs对体外成熟卵母细胞质量的影响。
在IVM培养后，检测MII期卵母细胞的ROS、GSH水平和线粒体膜电位。
DOEC-EVs对孤雌胚胎发育的影响
验证DOEC-EVs处理卵母细胞后对后续胚胎发育能力的影响。
对体外成熟的卵母细胞进行孤雌激活，培养至囊胚阶段，统计卵裂率、囊胚率和囊胚细胞总数。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | -- | -- |
| 牛血清 | Meiluncell | PWL001 | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| EV分离 | 超速离心机 | Hitachi | CP100MX |
| 0.45微米滤膜 | -- | -- | |
| EV表征 | NanoSight LM10系统 | NanoSight Ltd. | -- |
| 透射电子显微镜 | Hitachi | HT-7700 | |
| 蛋白提取和浓度测定 | RIPA裂解液 | Solarbio | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0011 | |
| 酶标仪 | Thermo Fisher | Varioskan | |
| Western blot | PVDF膜 | -- | -- |
| Tanon 5200化学发光成像分析仪 | Tanon Science Technology Co. Ltd. | -- | |
| 免疫荧光 | 细胞爬片 | NEST | -- |
| EV摄取实验 | 亲脂性红色荧光染料 | Beyotime | C1995S |
| 细胞外囊泡分离试剂盒 | Umibio | -- | |
| 共聚焦显微镜 | Leica | TCS-SP8 | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂 | Beyotime | -- |
| 酶标仪 | BioTek | Synergy | |
| 卵母细胞采集 | HEPES | GIBCO | 12350039 |
| 体视显微镜 | Nikon | SMZ800N | |
| 体外成熟 | IVM培养基 | IVF Bioscience | -- |
| 矿物油 | -- | -- | |
| 卵母细胞处理 | 透明质酸酶 | -- | -- |
| 孤雌激活 | 电穿孔仪 | BTX | ECM |
| 细胞松弛素B | -- | -- | |
| 胚胎培养 | BO-IVC培养基 | IVF Bioscience | -- |
| 细胞核染色 | Hoechst 33342 | -- | -- |
| 荧光显微镜 | Olympus | IX73 | |
| ROS检测 | 2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯 | Beyotime | -- |
| 4-氯甲基-6,8-二氟-7-羟基香豆素 | Invitrogen | -- | |
| 线粒体膜电位检测 | JC-1染料 | Beyotime | -- |
| 细胞增殖检测（EdU） | EdU染色缓冲液 | Beyotime | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC结合溶液 | Beyotime | -- |
| 碘化丙啶 | -- | -- | |
| 流式细胞仪 | BD Biosciences | LSRFortessa | |
| ATP检测 | 增强型ATP检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Tiangen | -- |
| NanoDrop ND-2000分光光度计 | NanoDrop Technologies | -- | |
| RT-qPCR | MonScript™ RTIII All-in-One Mix with dsDNase | Mona Bio | -- |
| FastQuant RT试剂盒 | Tiangen | -- | |
| MonAmp™ ChemoHS qPCR Mix | Mona Bio | -- | |
| 免疫荧光鉴定CK18 | CK18抗体 | Proteintech | 10830-1-AP |
| EV鉴定 | 抗CD9抗体 | Boster | BM4212 |
| 抗钙联蛋白抗体 | SAB | 12186 | |
| Western blot | 抗CX43抗体 | Proteintech | 26980-1-AP |
| 抗CX37抗体 | Bioss | bs-4067R | |
| 抗caspase-9抗体 | Proteintech | 10380-1-AP | |
| 免疫荧光 | 抗TOM20抗体 | Proteintech | 11802-1-AP |
| Western blot | 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 4970 |
| 免疫荧光 | 荧光标记二抗 | Abbkine | A23420 |
| 含DAPI的抗荧光淬灭剂 | Beyotime | P0131 | |
| 成像 | 数码相机 | Nikon | E179168 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| DOEC-EVs制备 | 细胞培养密度（80%融合度）、无血清DMEM孵育时间（48小时）、超速离心参数（2000 g, 30 min; 10000 g, 45 min; 100000 g, 70 min） 阅读提示：参见Materials and Methods中的Isolation of EVs from epithelial cells of the deer oviduct |
| DOEC-EVs处理浓度 | 最佳浓度为1×10^7个/mL，用于后续实验 阅读提示：参见Results中的Effects of DOEC-EVs on deer oocyte maturation |
| 卵母细胞体外成熟 | IVM培养基、培养温度38.5°C、5% CO2、湿度100%、培养时间28小时 阅读提示：参见Materials and Methods中的Collection and in vitro maturation of oocytes |
| 卵丘细胞培养与处理 | 细胞浓度1×10^6 cells/mL、EVs处理时间48小时、检测时间点 阅读提示：参见Materials and Methods中的Cell proliferation assay和Isolation and culture of deer CCs |
| 孤雌胚胎培养 | 电激活参数（160V, 10ms）、细胞松弛素B处理（7.5 μg/mL, 2小时）、培养条件（38.5°C, 5% CO2）、培养至第7天 阅读提示：参见Materials and Methods中的In vitro embryo culture and blastocyst cell number quantification |