建立人源化小鼠模型
验证患者PBMC能否在免疫缺陷小鼠中重建免疫系统并产生疾病表型。
将患者或健康对照的PBMC（1×10^6细胞）腹腔注射到BRGSF小鼠中，8周后检测人白细胞嵌合、抗GluN1抗体产生以及神经系统变化。
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患者外周血单个核细胞（PBMC）破坏血脑屏障并诱导抗NMDAR脑炎：新型人源化PBMC小鼠模型研究
Transfer of patient's peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) disrupts blood-brain barrier and induces anti-NMDAR encephalitis: a study of novel humanized PBMC mouse model
实验完整度
高包含体内模型（患者PBMC移植小鼠）、体外BBB模型、转录组分析、功能验证和行为学检测等多个独立证据层级，并进行了机制验证和治疗干预。
主要模型
患者PBMC移植的BRGSF小鼠模型 人源脑微血管内皮细胞系hCMEC/D3 体外BBB模型（hCMEC/D3与SVG p12共培养）
重点核对
模型品系：BALB/c Rag2−/−Il2rg−/−SirpαNODFlk2−/−（BRGSF）小鼠，雌性，8–10周龄 PBMC移植剂量：1×10^6个细胞，腹腔注射，培养8周 Anakinra治疗剂量：10 mg/kg/天，腹腔注射，持续8周 体外BBB模型：hCMEC/D3细胞与SVG p12细胞共培养，Anakinra浓度500 ng/mL 关键检测：紧连接蛋白（Claudin-1、Occludin、ZO-1、Claudin-5）表达，TEER和FITC-dextran通透性
摘要
背景：抗N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）脑炎是一种严重的自身免疫性神经精神疾病。抗NMDAR自身抗体通过血脑屏障（BBB）进入大脑对发病机制至关重要。以往大多数动物模型限制了患者BBB损伤病因的研究。方法：在本研究中，我们通过将患者外周血单个核细胞（PBMCs）腹腔注射到BALB/c Rag2−/−Il2rg−/−SirpαNODFlk2−/−小鼠中，建立了一种新型的抗NMDAR脑炎人源化小鼠模型。结果：我们发现患者PBMCs的植入不仅产生了强效的抗GluN1自身抗体，还破坏了BBB完整性，使自身抗体能够进入大脑，导致过度活跃的运动表型、焦虑和抑郁样行为、认知缺陷，以及相应脑区的功能改变。转录组分析提示小鼠模型中存在过度的免疫反应和受损的神经传递，并突出Il-1β为参与病理变化的关键基因。我们进一步证明Il-1β由内皮细胞产生，并通过抑制紧密连接蛋白来破坏BBB。给予Anakinra（一种Il-1受体拮抗剂）可改善BBB损伤和神经精神行为。结论：我们的研究提供了一种新型且临床相关性更高的人源化抗NMDAR脑炎小鼠模型，并揭示了患者淋巴细胞的固有致病特性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 患者来源的PBMCs是否能够通过破坏血脑屏障导致抗NMDAR脑炎，以及其潜在的分子机制是什么？
- 核心机制
- 患者PBMCs直接上调脑微血管内皮细胞中的Il-1β，Il-1β抑制紧密连接蛋白（Claudin-1、Occludin、ZO-1、Claudin-5）的表达，导致BBB通透性增加，自身抗体进入大脑，引发神经精神症状。
- 主要证据
- 人源化小鼠模型中检测到抗GluN1抗体和BBB渗漏；体外BBB模型显示患者PBMC降低TEER并增加通透性；过表达Il-1β降低紧密连接蛋白，敲低则相反；Anakinra治疗可逆转BBB损伤和行为异常。
- 研究意义
- 提供了一个临床相关性更高的人源化小鼠模型，揭示了患者淋巴细胞的致病性，并强调了阻断Il-1β信号作为治疗抗NMDAR脑炎的潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
行为学表型评估
评估患者PBMC移植是否会引起神经精神行为异常。
通过高架十字迷宫（EPM）、新物体识别（NORT）、强迫游泳（FST）、旷场实验（OFT）检测焦虑、认知和抑郁样行为。
BBB完整性检测
验证患者PBMC移植是否导致血脑屏障破坏。
通过免疫荧光检测纤维蛋白原外渗和紧密连接蛋白表达，并观察免疫细胞浸润。
转录组分析
揭示BBB损伤的分子机制并识别关键基因。
对小鼠脑组织进行bulk RNA-seq，分析差异表达基因、GO富集、GSEA和蛋白互作网络。
体外BBB模型验证
验证患者PBMC对BBB的直接影响及Il-1β的作用。
使用hCMEC/D3和SVG p12共培养模型，检测患者PBMC处理后的TEER、FITC-dextran通透性、紧密连接蛋白表达，并通过Il-1β过表达/敲低验证其因果作用。
药物治疗研究
评估阻断Il-1β信号是否可缓解疾病表型。
在体内和体外使用Anakinra阻断IL-1受体，检测对BBB完整性和行为表型的改善作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| DMEM培养基 | Gibco | C1995500BT | |
| 内皮细胞培养基 | Sciencell | 1001 | |
| 胎牛血清 | PAN | ST30-3302 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 明胶 | Solarbio | G0040 | |
| PBMC分离 | PBMC分离试剂盒 | TBD Science | LTS1077 |
| 细胞培养 | EDTA抗凝管 | -- | -- |
| 细胞冻存 | 含10% DMSO的冻存液 | -- | -- |
| NALGENE Cryo 1°C冻存盒 | Nalgene | -- | |
| 细胞培养 | 细胞培养小室 | Falcon | 353096 |
| 24孔细胞培养板配套板 | Falcon | 353504 | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000015 |
| Opti-MEM培养基 | Gibco | 31985070 | |
| P3000试剂 | Invitrogen | -- | |
| Il-1β过表达质粒 | Wzbio | CH842401 | |
| siRNA寡核苷酸 | RiboBio | -- | |
| Western blot | PVDF膜 | -- | -- |
| Immobilon Western化学发光HRP底物 | Merck | WBKLS0500 | |
| ImageQuant LAS 4000成像系统 | GE Healthcare Life Sciences | -- | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 488标记的山羊抗人IgG | Invitrogen | A-11013 |
| Alexa Fluor 555标记的山羊抗兔IgG | CST | 4417 | |
| DAPI | Sigma | -- | |
| Fluoro-Gel封片剂 | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| 免疫组化 | DAB显色试剂盒 | Gene Tech | GK600710 |
| 抗体检测 | 抗GluN1抗体 | Alomone | AGC-001 |
| 正常小鼠IgG | CST | 61656 | |
| HRP标记的抗人IgG二抗 | Bioss | bs-0297G-HRP | |
| HRP标记的抗兔IgG二抗 | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | |
| HRP标记的抗小鼠IgG二抗 | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| RNA-seq | NanoDrop ND-1000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Bioanalyzer 2100生物分析仪 | Agilent | -- | |
| Illumina Novaseq 6000测序平台 | Illumina | -- | |
| 流式细胞术 | Human TruStain FcX阻断剂 | Biolegend | 422302 |
| PE-Cy5标记抗人CD45抗体 | BD Biosciences | 555490 | |
| PE标记抗小鼠CD45抗体 | BD Biosciences | 561087 | |
| APC R700标记抗人CD3抗体 | BD Biosciences | 659119 | |
| APC标记抗人CD4抗体 | BD Biosciences | 565994 | |
| FITC标记抗人CD8抗体 | BD Biosciences | 555634 | |
| BV421标记抗人CD19抗体 | BD Biosciences | 562440 | |
| LSRFortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 红细胞裂解液 | Solarbio | R1010 | |
| 70 μm细胞筛网 | Biologix | 15-1070 | |
| 免疫荧光 | 抗纤维蛋白原抗体 | Novus | NBP2-80414 |
| 抗P-糖蛋白抗体 | Invitrogen | MA1-26528 | |
| 抗GFAP抗体 | CST | 3670S | |
| 抗Il-1β抗体 | Invitrogen | P420B | |
| 抗层粘连蛋白抗体 | Invitrogen | MA106100 | |
| 抗B220抗体 | eBioscience | 14-0452-86 | |
| Western blot | GAPDH抗体 | -- | -- |
| β-微管蛋白抗体 | -- | -- | |
| α-肌动蛋白抗体 | -- | -- | |
| H&E染色 | 分化液 | Servicebio | G1039 |
| 返蓝液 | Servicebio | G1040 | |
| 伊红 | Servicebio | G1001 | |
| 中性树胶 | Sinopharm | 10004160 | |
| Olympus IX-71倒置荧光显微镜 | Olympus | -- | |
| 动物实验 | BRGSF小鼠 | Cyagen Biosciences | -- |
| 药物处理 | 阿那白滞素 | -- | -- |
| MRI | BioSpec94/30 USR小动物扫描仪 | Bruker | -- |
| RT-qPCR | HiScript III逆转录预混液 | Vazyme | R323-01 |
| TransStart Tip Green qPCR预混液 | Transgen | AQ141 | |
| ABI StepOne Plus实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 细胞培养 | SVG p12细胞系 | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd. | ATCC CRL-8621 |
| hCMEC/D3细胞系 | EK-Bioscience | SCC066 | |
| HEK-293T细胞 | -- | -- | |
| 转染 | M68CT-GluN1质粒 | -- | -- |
| Dot blot | Bio-Dot点印迹仪 | Bio-Rad | 706545 |
| 硝酸纤维素膜 | -- | -- | |
| 牛血清白蛋白 | Jackson ImmunoResearch | 155681 | |
| 重组GluN1肽段（N21-Q559） | Alpalife | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 人类样本收集 | 患者诊断标准，PBMC样本采集时间、处理条件 阅读提示：Materials and methods: Patients and healthy subjects |
| 动物模型建立 | 小鼠品系、性别、年龄、饲养条件、细胞注射剂量和途径 阅读提示：Materials and methods: Mice, Human PBMC isolation and transfer; Figure 1A |
| 行为学测试 | 测试时间点、设备参数、测试环境、数据分析软件 阅读提示：Materials and methods: Behavioral assessments |
| BBB完整性检测 | 检测指标（纤维蛋白原外渗、紧密连接蛋白表达）、样本处理 阅读提示：Materials and methods: Immunofluorescence, Western blot; Results: Humanized patient-PBMC mice exhibited a leaky BBB |
| 转录组分析 | 样本量、RNA提取方法、测序平台、差异表达基因筛选标准、分析软件 阅读提示：Materials and methods: RNA-Seq analysis |
| 体外BBB模型 | 细胞系、培养条件、Transwell规格、TEER测量、FITC-dextran渗透实验细节 阅读提示：Materials and methods: In vitro model of blood–brain barrier, TEER measurement, FITC-dextran permeability assay |
| Anakinra治疗 | 剂量、给药途径、给药频率、治疗时间 阅读提示：Materials and methods: Anakinra treatment |