单细胞转录组分析
筛选响应扰动流和动脉粥样硬化刺激的内皮细胞中非典型化学吸引物受体表达变化
对野生型小鼠左颈动脉进行PCL手术1或2天后获取单细胞RNA测序数据，同时分析ApoE−/−小鼠主动脉根的scRNA-seq数据集GSE131776，鉴定内皮亚群中CCRL2的表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
扰动流诱导的内皮CCRL2通过单核细胞中chemerin依赖的β2整合素激活促进动脉粥样硬化
Endothelial CCRL2 induced by disturbed flow promotes atherosclerosis via chemerin-dependent β2 integrin activation in monocytes
实验完整度
高包含细胞实验（HUVECs、THP-1）、动物模型（CCRL2−/−ApoE−/−、PCL手术）、患者样本（AAS血清及人颈动脉斑块）及功能与机制验证（β2整合素激活、ERK1/2磷酸化、PDI样酶活性）。
主要模型
CCRL2−/−ApoE−/−小鼠（高脂饮食诱导动脉粥样硬化） 部分颈动脉结扎（PCL）诱导的扰动流小鼠模型 人脐静脉内皮细胞（HUVECs） THP-1单核细胞
重点核对
CCRL2敲除对动脉粥样硬化斑块形成的保护作用 扰动流诱导内皮CCRL2表达的上调 chemerin对β2整合素和ERK1/2的激活 chemerin的PDI样酶活性
摘要
目的：化学吸引物及其同源受体在动脉粥样硬化形成过程中对白细胞募集至关重要，而动脉粥样硬化斑块优先发生在动脉壁中具有扰动流（d-flow）的易感部位。在对非典型化学吸引物受体（ACKRs）的内皮表达进行分析时，我们发现在动脉粥样硬化刺激下，一个内皮亚群中Ackr5（CCRL2）上调。因此，我们研究了CCRL2及其配体chemerin在动脉粥样硬化中的作用及其潜在机制。方法和结果：通过分析d-flow下左颈动脉的scRNA-seq数据和来自Gene Expression Omnibus数据库中ApoE−/−小鼠的scRNA-seq数据集GSE131776，我们发现CCRL2在响应d-flow刺激和动脉粥样硬化的一个内皮细胞亚群中上调。利用CCRL2−/−ApoE−/−小鼠，我们证明了CCRL2缺陷主要在高脂饮食喂养的ApoE−/−小鼠主动脉弓的d-flow区域保护斑块形成。扰动流诱导血管内皮CCRL2表达，募集chemerin，引起白细胞粘附于内皮。令人惊讶的是，chemerin不结合单核细胞CMKLR1，而是激活β2整合素，增强ERK1/2磷酸化和单核细胞粘附。此外，chemerin被发现具有蛋白二硫键异构酶样酶活性，该活性负责chemerin与β2整合素的相互作用，如通过Di-E-GSSG测定和邻位连接测定所鉴定的。临床相关性方面，与健康个体相比，急性动脉粥样硬化性血栓形成卒中患者的血清chemerin水平相对较高。结论：我们的研究结果表明，d-flow诱导的CCRL2通过新型CCRL2-chemerin-β2整合素轴促进动脉粥样硬化斑块形成，为动脉粥样硬化的预防或治疗干预提供了潜在靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 扰动流如何通过内皮CCRL2及其配体chemerin促进动脉粥样硬化？
- 核心机制
- 扰动流诱导内皮CCRL2表达，募集chemerin，chemerin通过其PDI样酶活性直接激活单核细胞β2整合素，增强ERK1/2磷酸化，促进单核细胞粘附和斑块形成。
- 主要证据
- 通过scRNA-seq鉴定内皮CCRL2上调；CCRL2缺陷减少ApoE−/−小鼠斑块；体外实验表明chemerin激活β2整合素和ERK1/2，且Di-E-GSSG和PLA证实chemerin的PDI样活性及与β2整合素相互作用；AAS患者血清chemerin水平升高。
- 研究意义
- 为动脉粥样硬化的预防或治疗干预提供潜在靶点，血清chemerin可能作为急性动脉粥样硬化性血栓形成卒中的生物标志物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CCRL2表达与动脉粥样硬化相关性分析
明确CCRL2在动脉粥样硬化发生过程中的表达变化及其与病变的相关性
通过RT-qPCR和Western blot检测高脂饮食喂养ApoE−/−小鼠主动脉CCRL2表达，免疫荧光染色观察CCRL2在斑块和内皮中的定位。
CCRL2缺陷对动脉粥样硬化斑块形成的影响
验证CCRL2缺失是否减少动脉粥样硬化斑块和巨噬细胞积累
比较CCRL2+/+ApoE−/−和CCRL2−/−ApoE−/−小鼠在高脂饮食4或16周后的斑块面积、主动脉根部油红O染色及巨噬细胞免疫染色。
扰动流对CCRL2表达的诱导
验证扰动流是否上调血管内皮CCRL2表达
通过锥板剪切应力装置在体外模拟振荡剪切应力和层流剪切应力作用于HUVECs，检测CCRL2 mRNA和蛋白表达；体内通过部分颈动脉结扎手术诱导扰动流，检测CCRL2表达。
内皮CCRL2在体内白细胞粘附中的作用
确定扰动流诱导的内皮CCRL2是否促进体内白细胞粘附
通过骨髓移植构建嵌合小鼠（GFP+骨髓移植至CCRL2+/+或CCRL2−/−受体），经PCL诱导扰动流后，通过免疫荧光染色计数粘附的白细胞。
CCRL2缺陷对扰动流诱导的斑块形成的影响
验证CCRL2是否在扰动流诱导的动脉粥样硬化中起作用
通过部分颈动脉结扎联合高脂饮食2周诱导斑块形成，比较CCRL2−/−ApoE−/−和CCRL2+/+ApoE−/−小鼠的颈动脉病变面积，并进行骨髓移植实验。
Chemerin在CCRL2介导的白细胞粘附中的作用
探讨CCRL2募集的chemerin是否介导白细胞粘附
检测高脂饮食小鼠主动脉及血清chemerin水平，通过免疫荧光染色观察CCRL2缺陷对chemerin内皮定位的影响；体外通过抗chemerin中和抗体处理，评估其对白细胞粘附的影响。
Chemerin激活β2整合素及下游ERK1/2
验证chemerin是否通过β2整合素和ERK1/2信号促进单核细胞粘附
使用重组人chemerin157S刺激THP-1细胞，流式检测β2整合素激活，Western blot检测ERK1/2磷酸化，使用β2整合素阻断抗体MEM148和ERK抑制剂U0126验证信号通路，并通过细胞粘附实验评估功能。
Chemerin的PDI样酶活性及其与β2整合素的相互作用
揭示chemerin激活β2整合素的机制
通过Di-E-GSSG还原实验检测chemerin157S的酶活性，使用序列比对和分子对接预测相互作用位点，并通过邻位连接实验验证chemerin与β2整合素的直接结合。
临床样本分析
评估chemerin与人类动脉粥样硬化性卒中相关性
通过免疫组化检测人颈动脉斑块中CCRL2和chemerin表达；采用ELISA检测111例急性动脉粥样硬化性血栓形成卒中患者和111例对照的血清chemerin水平，并进行逻辑回归和ROC曲线分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
单细胞转录组分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | M199培养基 | Coring | -- |
| RPMI-1640培养基 | HyClone | -- | |
| 胎牛血清 | HyClone | -- | |
| 青霉素/链霉素/两性霉素B | Gibco | -- | |
| 谷氨酰胺补充剂 | Coring | -- | |
| 肝素 | McKesson Medical | -- | |
| 动物实验 | 异氟烷 | -- | -- |
| Western blot | 抗β-肌动蛋白抗体 | Beyotime | AA128 |
| 抗β-微管蛋白抗体 | Multi Sciences | 70-ab009-040 | |
| 抗磷酸化ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 9102S | |
| 抗ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 4376S | |
| 免疫荧光 | 抗MoMa-2抗体 | Abcam | ab33451 |
| 抗CD31抗体 | BD Pharmingen | 553370 | |
| 抗CCRL2抗体 | Thermo Fisher | 498321 | |
| 抗CCRL2抗体 | Abcam | ab88632 | |
| 抗chemerin抗体 | Abcam | ab103531 | |
| 抗chemerin抗体 | Bioss | bs-1501R | |
| 细胞粘附实验 | 鬼笔环肽 | Thermo Fisher | R415 |
| 动物实验 | Harlan Teklad高脂饲料88137 | Harlan Teklad | -- |
| ELISA | Chemerin ELISA试剂盒 | Cloud-Clone | SEA945Hu |
| 细胞粘附实验 | 钙黄绿素-AM | Thermo Fisher | 65-0855-39 |
| 抗chemerin阻断抗体 | R&D | AF2325 | |
| 细胞培养 | Dill染色剂 | Beyotime | C1036 |
| PLA | 抗CD18抗体 | Proteintech | 10554-1-AP |
| 抗chemerin抗体 | Cloud-Clone Corp | MAA945Hu22 | |
| 邻位连接试剂盒 | Sigma | DUO92101 | |
| RT-qPCR | 总RNA提取试剂盒 | TIANGEN | DP419 |
| 逆转录预混液 | TAKARA | -- | |
| SYBR Green PCR预混液 | Thermo Fisher | A46109 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型构建 | CCRL2−/−ApoE−/−小鼠杂交方案、高脂饲料配方（0.15%胆固醇、21%脂肪，无胆酸盐，Harlan Teklad diet No. 88137）、PCL手术步骤、麻醉方案（1%戊巴比妥7 μL/g腹腔注射；异氟烷3%吸入） 阅读提示：Methods 2.2 和 2.6 |
| 细胞培养和剪切应力实验 | HUVECs培养条件（M199培养基、10% FBS等）、剪切应力参数（OS 10±5 dyn/cm²，LS 30 dyn/cm²，处理24小时）、THP-1细胞培养环境（RPMI-1640培养基、10% FBS） 阅读提示：Methods 2.10 和 2.13 |
| 白细胞粘附实验 | 主动脉分离和开窗过程、白细胞分离和标记（Calcein-AM）、共孵育时间（60分钟）、中性抗体浓度（10 μg/mL） 阅读提示：Methods 2.9 和 2.16 |
| 信号通路验证 | Chem157S浓度（100 ng/mL）和刺激时间（5分钟）、β2整合素阻断抗体MEM148和ERK抑制剂U0126的浓度（文中未明确说明）、Di-E-GSSG实验试剂浓度（200 nM Chem157S、20 nM ERp57、150 nM Di-E-GSSG、5 μM DTT） 阅读提示：Methods 2.14-2.16 和 3.5 |
| 临床样本检测 | 血清样本采集时间、ELISA试剂盒（SEA945Hu）使用条件、统计分析调整变量（BMI、TC、TG、LDL、HDL、空腹血糖、吸烟、饮酒） 阅读提示：Methods 2.1 和 3.6 |