检测山羊早期妊娠子宫中m6A和METTL3表达水平
确定m6A修饰及METTL3在山羊早期妊娠子宫中的表达变化。
收集不同妊娠天数（D0-D25）的山羊子宫，使用m6A RNA甲基化定量试剂盒检测总RNA m6A水平，RT-qPCR检测METTL3 mRNA水平，原位杂交和免疫组化检测METTL3 mRNA和蛋白的定位与表达。
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METTL3通过m6A依赖性方式调控CTGF促进山羊子宫内膜上皮细胞增殖
METTL3 promotes proliferation of goat endometrial epithelial cells by regulating CTGF in an m6A-dependent manner†
实验完整度
高包含体内模型（妊娠山羊、去卵巢激素注射模型）和体外细胞模型（原代EECs、HEK293T），进行了功能验证（敲低/过表达）、机制验证（MeRIP、荧光素酶报告基因）和回复实验（CTGF敲低）。
主要模型
山羊原代子宫内膜上皮细胞（EECs） 去卵巢山羊激素注射模型 妊娠山羊子宫组织 HEK293T细胞
重点核对
METTL3表达水平：通过siRNA敲低或pcDNA3.1-METTL3过表达验证。 总RNA及CTGF mRNA m6A水平：使用m6A RNA甲基化定量试剂盒和MeRIP检测。 METTL3对CTGF 3'UTR的靶向作用：通过荧光素酶报告基因实验验证。 CTGF在METTL3促进EEC增殖中的作用：通过CTGF siRNA敲低进行功能回复实验。 EEC增殖检测：使用EdU实验和PCNA蛋白表达水平评估。
摘要
N6-甲基腺苷（m6A）是一种RNA上的表观遗传修饰，在许多生理和病理过程中发挥重要作用。然而，m6A在山羊早期妊娠子宫中的作用仍 largely 未知。本研究发现，随着早期妊娠的进展，山羊子宫总m6A水平逐渐升高。甲基转移酶样3（METTL3）是m6A甲基转移酶的核心催化亚基。因此，我们确定了METTL3在山羊子宫中的表达和调控。METTL3在妊娠第16天（D16）至第25天（D25）的腔内和腺上皮中高表达，并且雌激素和孕酮可在山羊子宫和原代子宫内膜上皮细胞（EECs）中上调其表达。在EECs中，敲低或过表达METTL3分别导致细胞增殖显著减少或增加。METTL3敲低不仅降低了总RNA的m6A水平，也降低了结缔组织生长因子（CTGF）mRNA的m6A水平。荧光素酶实验表明，METTL3可能靶向CTGF mRNA 3'非翻译区（3'UTR）中潜在的m6A位点。此外，METTL3正向调控CTGF表达，而CTGF敲低显著抵消了METTL3过表达对EEC增殖的促进作用。总之，METTL3在山羊子宫中动态表达，并可通过m6A依赖性方式调控CTGF影响EEC增殖。我们的结果将为进一步研究METTL3介导的m6A修饰在山羊早期妊娠子宫中的关键机制奠定基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- METTL3介导的m6A修饰在山羊早期妊娠子宫中的作用及其分子机制。
- 核心机制
- METTL3通过靶向CTGF mRNA 3'UTR中潜在的m6A位点，在m6A依赖性方式下正向调控CTGF表达，进而促进山羊子宫内膜上皮细胞增殖。
- 主要证据
- 妊娠山羊子宫中m6A和METTL3水平升高；雌激素和孕酮上调METTL3；METTL3敲低/过表达影响EEC增殖；MeRIP和荧光素酶实验证实METTL3靶向CTGF 3'UTR；CTGF敲低逆转METTL3过表达对增殖的促进作用。
- 研究意义
- 揭示了METTL3介导的m6A修饰在山羊早期妊娠子宫中的新机制，为理解早期妊娠的转录后表观遗传调控提供了基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测雌激素和孕酮对METTL3表达的调控
验证性激素能否调控METTL3在山羊子宫和EECs中的表达。
对去卵巢山羊注射雌二醇（E2）或孕酮（P4）后，通过免疫组化和Western blot检测子宫中METTL3蛋白水平。对原代EECs给予不同浓度E2或P4处理，RT-qPCR检测METTL3 mRNA水平。
验证METTL3对EEC增殖的功能影响
确定METTL3是否影响山羊EEC增殖。
在EECs中转染METTL3 siRNA（siMETTL3）或pcDNA3.1-METTL3（oe-METTL3），通过Western blot检测METTL3和PCNA蛋白水平，EdU实验检测细胞增殖率。
验证METTL3对CTGF mRNA m6A修饰的影响
探究METTL3是否调控CTGF mRNA的m6A修饰水平。
通过MeRIP结合RT-qPCR检测METTL3敲低后CTGF mRNA的m6A富集变化。使用m6A RNA甲基化定量试剂盒检测总RNA m6A水平。
验证METTL3对CTGF 3'UTR的靶向作用
确定METTL3是否直接靶向CTGF mRNA的3'UTR区域。
构建包含CTGF 5'UTR、CDS、3'UTR的野生型（WT）和3'UTR突变型（MUT）荧光素酶报告质粒，与pcDNA3.1-METTL3共转染HEK293T细胞，检测荧光素酶活性。
验证CTGF在METTL3促进EEC增殖中的作用
验证CTGF是否为METTL3促进EEC增殖的下游效应分子。
在EECs中共转染oe-METTL3和CTGF siRNA（siCTGF），通过Western blot检测CTGF和PCNA蛋白水平，EdU实验检测细胞增殖率。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | 未明确说明 | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 胶原酶II | Biosharp | -- | |
| 胰蛋白酶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 细胞增殖检测 | EdU实验试剂盒 | RiBoBio | -- |
| Hoechst 33342 | -- | -- | |
| RNA提取和RT-qPCR | HiPure总RNA提取试剂盒 | Magen | -- |
| Nanodrop® 2000分光光度计 | Thermo-Scientific | -- | |
| GoScript™逆转录Mix | Promega | -- | |
| SYBR Green预混液 | TaKaRa | -- | |
| Applied Biosystems® 7500实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| RNA m6A定量 | EpiQuik m6A RNA甲基化定量试剂盒 | Epigentek | -- |
| MeRIP | EpiQuik m6A RNA富集试剂盒 | Epigentek | -- |
| High Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| ECL化学发光液 | Biosharp | -- | |
| 免疫组织化学 | DAB显色试剂 | ORiGene | -- |
| 激素处理 | 17β-雌二醇 | Sigma-Aldrich | -- |
| 孕酮 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 荧光素酶实验 | Dual-Glo荧光素酶检测系统 | Promega | -- |
| 抗体 | 抗CK-18抗体 | Boster | BM0032 |
| 抗波形蛋白抗体 | Boster | BM0135 | |
| 兔抗小鼠IgG H&L (FITC)二抗 | Bioss | bs-0296R | |
| 抗METTL3抗体 | Proteintech | 15073-1-AP | |
| 抗PCNA抗体 | ABclonal | A13336 | |
| 抗CTGF抗体 | Proteintech | 25474-1-AP | |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | ab22555 | |
| 小鼠抗兔IgG/HRP二抗 | Bioss | bs-0295M | |
| 山羊抗兔IgG/HRP二抗 | Bioss | bs-0295G | |
| 细胞培养 | pcDNA3.1载体 | Invitrogen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型和样品收集 | 妊娠天数分组（D0、D6、D16、D19、D25），每组动物数（n=5） 阅读提示：Materials and methods - Animals and tissue collection |
| 激素处理 | 去卵巢山羊激素注射剂量（E2 50μg/mL，P4 500mg/mL）和处理时间（24小时）；EECs激素处理浓度（0.1-100 nM）和时间（24小时） 阅读提示：Materials and methods - Goat ovariectomy and hormone injection, Hormone treatment |
| 细胞培养 | 原代EECs分离方法、培养基（DMEM/F12+10%FBS）、培养条件（37°C、5% CO2）、消化条件（0.25%胰蛋白酶） 阅读提示：Materials and methods - Goat primary EECs |
| 细胞转染 | siRNA浓度（100 nM）、质粒量（6 μg）、转染试剂（Lipofectamine 2000） 阅读提示：Materials and methods - Cell transfection |
| MeRIP | 使用EpiQuik m6A RNA Enrichment Kit，RT-qPCR使用10 ng RNA 阅读提示：Materials and methods - Methylated RNA immunoprecipitation |