动物模型建立与饮食干预
建立晚期动脉粥样硬化模型并施加菊苣干预,以评估其对主动脉斑块的影响。
30周龄雄性Apoe−/−小鼠随机分组,对照组喂AIN-93G饮食,干预组补充0.5%冻干芽球菊苣,持续20周。
Re-Visiting Antioxidant Therapy in Murine Advanced Atherosclerosis with Brussels Chicory, a Typical Vegetable in Mediterranean Diets
包含动物模型、体外功能检测(血管环、单核细胞粘附)和分子机制验证(qRT-PCR、活性检测),且多层级证据独立。
30周龄雄性Apoe−/−小鼠(C57BL/6J背景) HL-60单核细胞 主动脉血管环
小鼠周龄:30周龄开始干预,持续20周 饮食:AIN-93G添加0.5%冻干芽球菊苣 样本量:每组15只小鼠 血管环预收缩剂:1μmol/L苯肾上腺素 NOX抑制剂:apocynin 100μmol/L
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立晚期动脉粥样硬化模型并施加菊苣干预,以评估其对主动脉斑块的影响。
30周龄雄性Apoe−/−小鼠随机分组,对照组喂AIN-93G饮食,干预组补充0.5%冻干芽球菊苣,持续20周。
评估斑块大小及稳定性指标(坏死核大小、纤维帽厚度、胶原含量、脂质含量)。
对主动脉根部连续冰冻切片(8μm)进行H&E染色测量斑块大小、坏死核和纤维帽厚度,Sirius Red染色定量胶原,油红O染色检测中性脂质。
检测斑块内凋亡细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞含量。
通过免疫组化检测cleaved CASP3、CD68和ACTA2阳性细胞,计算阳性比例。
评估内皮依赖性松弛和非依赖性松弛,以及单核细胞粘附。
胸主动脉环置于器官浴槽中,预收缩后累积浓度Ach测量内皮依赖性松弛,SNP测量内非依赖性松弛;L-NAME孵育验证eNOS作用。离体主动脉段与标记的HL-60单核细胞孵育,计数粘附细胞。
评估斑块内超氧阴离子水平及氧化产物ox-LDL和4-HNE含量。
冰冻切片DHE染色检测活性氧,免疫组化检测ox-LDL和4-HNE阳性面积。
确定菊苣影响自由基产生的途径(NOX、eNOS、XO)。
利用化学发光法检测主动脉环基础及NADH/NADPH刺激的超氧水平,并加入抑制剂(apocynin、L-NAME、oxypurinol)确定来源。分别测定eNOS和XO活性,qRT-PCR检测基因表达。
评估菊苣是否影响自由基清除系统(酶性和非酶性抗氧化剂)。
测定主动脉和血清中SOD、CAT、GPx活性,GSH/GSSG含量,以及血清非酶性抗氧化剂(胆红素、尿酸、白蛋白、维生素E、维生素C)。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | AIN-93G饲料 | -- | -- |
| 冻干芽球菊苣 | Hebei Vilof Agritech Co., Ltd. | -- | |
| 组织学染色 | 伊红 | -- | -- |
| 天狼星红 | -- | -- | |
| 油红O | -- | -- | |
| 免疫组化 | 抗CD68抗体 | Invitrogen | 14-0681-82 |
| 抗ACTA2抗体 | Invitrogen | PA5-85070 | |
| 抗裂解CASP3抗体 | Cell Signaling Technology | 9664 | |
| 主动脉舒张实验 | 乙酰胆碱 | Sigma-Aldrich | A6625 |
| 硝普钠 | Sigma-Aldrich | 71778 | |
| L-NAME | Sigma-Aldrich | N5751 | |
| 单核细胞粘附实验 | 钙黄绿素-AM | -- | -- |
| 氧化应激检测 | 二氢乙啶 | Thermo Fisher Scientific | D11347 |
| 免疫组化 | 抗ox-LDL抗体 | Bioss | bs-1698R |
| 抗4-HNE抗体 | Invitrogen | MA5-27570 | |
| 超氧检测 | 光泽精 | -- | -- |
| NADH | Beyotime | ST358 | |
| NADPH | Beyotime | ST360 | |
| 夹竹桃麻素 | Sigma-Aldrich | 178385 | |
| 氧嘌呤醇 | Sigma-Aldrich | O6881 | |
| 酶活性检测 | eNOS检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A014 |
| 蝶呤 | Sigma-Aldrich | P1132 | |
| 黄油XO | Merck Millipore | 682151 | |
| 抗氧化酶活性检测 | SOD检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A001-3 |
| 过氧化氢 | -- | -- | |
| qRT-PCR | TRI试剂 | Invitrogen | AM9738 |
| QuantiTect逆转录试剂盒 | Qiagen | 205311 | |
| SYBR Green PCR预混液 | Thermo Fisher | 4309155 | |
| ABI 7300实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 血清白蛋白检测 | 小鼠血清白蛋白ELISA试剂盒 | Sangon Biotech | D721206 |
| 尿酸检测 | 尿酸检测试剂盒 | Abcam | ab65344 |
| 维生素检测 | 维生素C比色法试剂盒 | Elabscience | E-BC-K034 |
| 维生素E比色法试剂盒 | Elabscience | E-BC-K033 | |
| 总胆红素比色法试剂盒 | Elabscience | E-BC-K760 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系(Apoe−/−)、年龄(30周)、性别(雄性)、背景(C57BL/6J)、饲养环境 阅读提示:参见2.1节 |
| 饮食干预 | 菊苣剂量(0.5%冻干)、饲料类型(AIN-93G)、干预周期(20周) 阅读提示:参见2.1节和补充表S1 |
| 主动脉舒张实验 | 血管环长度(3mm)、预张力(30mN)、预收缩剂(PE 1μmol/L)、ACh浓度梯度、L-NAME浓度(300μmol/L) 阅读提示:参见2.4节 |
| 氧化应激检测 | DHE浓度(2μmol/L)、孵育时间(30min)、显微镜设置 阅读提示:参见2.6节 |
| 自由基检测 | lucigenin浓度(5μmol/L)、NADH/NADPH浓度(0.2和1mmol/L)、抑制剂浓度(100μmol/L)、孵育时间 阅读提示:参见2.8节 |
| 统计方法 | 正态性检验(Kolmogorov-Smirnov)、t检验类型(双尾非配对)、软件版本(GraphPad Prism 9.3.1) 阅读提示:参见2.13节 |