重新探讨地中海饮食典型蔬菜芽球菊苣在小鼠晚期动脉粥样硬化中的抗氧化治疗

Re-Visiting Antioxidant Therapy in Murine Advanced Atherosclerosis with Brussels Chicory, a Typical Vegetable in Mediterranean Diets

作者信息Qing Li, Yushi Du, Panyin Xiang, Guanyu Chen, Xiaoxian Qian, Shuangshuang Li, Yihui Mao, Wenhua Ling, Dongliang Wang
PMID36839190
期刊Nutrients
发布时间2023-02-06
DOI10.3390/nu15040832

实验完整度

高

包含动物模型、体外功能检测(血管环、单核细胞粘附)和分子机制验证(qRT-PCR、活性检测),且多层级证据独立。

主要模型

30周龄雄性Apoe−/−小鼠(C57BL/6J背景) HL-60单核细胞 主动脉血管环

重点核对

小鼠周龄:30周龄开始干预,持续20周 饮食:AIN-93G添加0.5%冻干芽球菊苣 样本量:每组15只小鼠 血管环预收缩剂:1μmol/L苯肾上腺素 NOX抑制剂:apocynin 100μmol/L

摘要

芽球菊苣是地中海饮食中的典型蔬菜,最近有报道称其能稳定apoE缺乏(Apoe−/−)小鼠头臂动脉中的晚期动脉粥样硬化斑块。在此,我们研究了芽球菊苣是否通过改善氧化应激来稳定主动脉中的晚期斑块。30周龄的Apoe−/−小鼠喂食AIN-93G饮食或添加0.5%冻干芽球菊苣的饮食二十周。测量了主动脉斑块大小和稳定性、主动脉松弛、单核细胞与主动脉内皮的粘附、自由基,以及主动脉和血清中参与自由基产生和消除的酶性和非酶性因素。芽球菊苣的摄入并未改变主动脉斑块大小,但它稳定了主动脉斑块,促进了主动脉松弛,并抑制了单核细胞与主动脉内皮的粘附。此外,这种给药减少了主动脉斑块中的氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)和4-羟基壬烯醛(4-HNE)含量,这与抑制主动脉NADPH氧化酶(NOX)和解偶联的内皮一氧化氮合酶(eNOS)介导的自由基产生相关。然而,芽球菊苣的摄入并未显著改变主动脉和血清中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的活性,主动脉谷胱甘肽(GSH),以及血清非酶性抗氧化剂如胆红素、尿酸和GSH。总之,改善氧化应激可能有助于芽球菊苣的抗动脉粥样硬化作用,支持在晚期动脉粥样硬化进展中使用抗氧化治疗的前景。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
芽球菊苣是否通过改善主动脉氧化应激来稳定晚期动脉粥样硬化斑块?
核心机制
芽球菊苣通过抑制NADPH氧化酶(NOX)活性和逆转eNOS解偶联,减少自由基产生,从而改善斑块内氧化应激,但不影响自由基清除系统。
主要证据
在Apoe−/−小鼠中,芽球菊苣减少主动脉斑块氧化应激(DHE染色降低)、ox-LDL和4-HNE含量,同时抑制NOX和eNOS介导的自由基产生,且不影响SOD、CAT、GPx活性及GSH水平。
研究意义
研究支持富含多酚的完整食物(如菊苣)而非单一抗氧化维生素可能成为防治心血管疾病的策略,并呼吁重新审视抗氧化治疗在晚期动脉粥样硬化中的潜力。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

动物模型建立与饮食干预

建立晚期动脉粥样硬化模型并施加菊苣干预,以评估其对主动脉斑块的影响。

30周龄雄性Apoe−/−小鼠随机分组,对照组喂AIN-93G饮食,干预组补充0.5%冻干芽球菊苣,持续20周。

2

主动脉斑块形态学分析

评估斑块大小及稳定性指标(坏死核大小、纤维帽厚度、胶原含量、脂质含量)。

对主动脉根部连续冰冻切片(8μm)进行H&E染色测量斑块大小、坏死核和纤维帽厚度,Sirius Red染色定量胶原,油红O染色检测中性脂质。

3

斑块细胞组成分析

检测斑块内凋亡细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞含量。

通过免疫组化检测cleaved CASP3、CD68和ACTA2阳性细胞,计算阳性比例。

4

主动脉内皮功能检测

评估内皮依赖性松弛和非依赖性松弛,以及单核细胞粘附。

胸主动脉环置于器官浴槽中,预收缩后累积浓度Ach测量内皮依赖性松弛,SNP测量内非依赖性松弛;L-NAME孵育验证eNOS作用。离体主动脉段与标记的HL-60单核细胞孵育,计数粘附细胞。

5

氧化应激水平检测

评估斑块内超氧阴离子水平及氧化产物ox-LDL和4-HNE含量。

冰冻切片DHE染色检测活性氧,免疫组化检测ox-LDL和4-HNE阳性面积。

6

自由基来源分析和酶活性检测

确定菊苣影响自由基产生的途径(NOX、eNOS、XO)。

利用化学发光法检测主动脉环基础及NADH/NADPH刺激的超氧水平,并加入抑制剂(apocynin、L-NAME、oxypurinol)确定来源。分别测定eNOS和XO活性,qRT-PCR检测基因表达。

7

抗氧化系统评估

评估菊苣是否影响自由基清除系统(酶性和非酶性抗氧化剂)。

测定主动脉和血清中SOD、CAT、GPx活性,GSH/GSSG含量,以及血清非酶性抗氧化剂(胆红素、尿酸、白蛋白、维生素E、维生素C)。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
AIN-93G饲料----
冻干芽球菊苣Hebei Vilof Agritech Co., Ltd.--
伊红----
天狼星红----
油红O----
抗CD68抗体Invitrogen14-0681-82
抗ACTA2抗体InvitrogenPA5-85070
抗裂解CASP3抗体Cell Signaling Technology9664
乙酰胆碱Sigma-AldrichA6625
硝普钠Sigma-Aldrich71778
L-NAMESigma-AldrichN5751
钙黄绿素-AM----
二氢乙啶Thermo Fisher ScientificD11347
抗ox-LDL抗体Biossbs-1698R
抗4-HNE抗体InvitrogenMA5-27570
光泽精----
NADHBeyotimeST358
NADPHBeyotimeST360
夹竹桃麻素Sigma-Aldrich178385
氧嘌呤醇Sigma-AldrichO6881
eNOS检测试剂盒Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA014
蝶呤Sigma-AldrichP1132
黄油XOMerck Millipore682151
SOD检测试剂盒Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA001-3
过氧化氢----
TRI试剂InvitrogenAM9738
QuantiTect逆转录试剂盒Qiagen205311
SYBR Green PCR预混液Thermo Fisher4309155
ABI 7300实时荧光定量PCR系统Applied Biosystems--
小鼠血清白蛋白ELISA试剂盒Sangon BiotechD721206
尿酸检测试剂盒Abcamab65344
维生素C比色法试剂盒ElabscienceE-BC-K034
维生素E比色法试剂盒ElabscienceE-BC-K033
总胆红素比色法试剂盒ElabscienceE-BC-K760

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物模型
小鼠品系(Apoe−/−)、年龄(30周)、性别(雄性)、背景(C57BL/6J)、饲养环境
阅读提示:参见2.1节
饮食干预
菊苣剂量(0.5%冻干)、饲料类型(AIN-93G)、干预周期(20周)
阅读提示:参见2.1节和补充表S1
主动脉舒张实验
血管环长度(3mm)、预张力(30mN)、预收缩剂(PE 1μmol/L)、ACh浓度梯度、L-NAME浓度(300μmol/L)
阅读提示:参见2.4节
氧化应激检测
DHE浓度(2μmol/L)、孵育时间(30min)、显微镜设置
阅读提示:参见2.6节
自由基检测
lucigenin浓度(5μmol/L)、NADH/NADPH浓度(0.2和1mmol/L)、抑制剂浓度(100μmol/L)、孵育时间
阅读提示:参见2.8节
统计方法
正态性检验(Kolmogorov-Smirnov)、t检验类型(双尾非配对)、软件版本(GraphPad Prism 9.3.1)
阅读提示:参见2.13节