体内感染模型建立与全身感染评估
评估SopF对S. Typhimurium感染后小鼠死亡率、细菌载量和肠道炎症的影响。
使用链霉素预处理C57BL/6小鼠，口服感染STM-WT、STM-ΔsopF或STM-ΔsopF/psopF（5×10^7 CFU），监测生存率、体重变化，检测肝脏和脾脏细菌载量，观察肠道形态和组织病理，检测炎性细胞因子转录水平。
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沙门氏菌效应蛋白SopF通过调控肠上皮细胞的PANoptosis加重全身感染
Salmonella effector SopF regulates PANoptosis of intestinal epithelial cells to aggravate systemic infection
实验完整度
高研究包含小鼠感染模型、IECs分离、细胞实验、Western blot、免疫荧光、TEM、抑制剂处理、免疫沉淀等多个独立证据层级，并进行功能验证和机制验证。
主要模型
链霉素预处理的C57BL/6小鼠感染鼠伤寒沙门氏菌模型 Caco-2人结肠癌细胞 NCM460人正常结肠上皮细胞 293T细胞
重点核对
感染菌株：STM-WT、STM-ΔsopF、STM-ΔsopF/psopF，链霉素预处理小鼠经口感染5×10^7 CFU 细胞感染：MOI=100，感染后1h换含100μg/ml阿米卡星的培养基，2h后换含10μg/ml阿米卡星的培养基 抑制剂处理：AR-12 (1μM) 和 BI-D1870 (10μM) 感染前1h预处理 Bafilomycin A1处理：100nM感染前2h预处理 统计：数据以均值±SD表示，多组间比较采用one-way ANOVA，生存曲线采用log-rank检验，P<0.05为差异显著
摘要
SopF是沙门氏菌致病岛1型三型分泌系统（T3SS1）分泌的一种新发现的效应蛋白，据报道其靶向宿主细胞膜上的磷脂酰肌醇并加重全身感染，但其功能相关性和潜在机制尚未阐明。肠上皮细胞（IECs）的PANoptosis（焦亡、凋亡和坏死性凋亡）已被认为是限制食源性病原体传播的关键宿主防御机制，而SopF对沙门氏菌诱导的IECs PANoptosis的影响却相当有限。在此，我们证明SopF在感染鼠伤寒沙门氏菌（S. Typhimurium）的小鼠中能够减轻肠道炎症并抑制IECs的脱落以促进细菌传播。我们发现SopF能激活磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1（PDK1）以磷酸化p90核糖体S6激酶（RSK），从而下调Caspase-8的激活。SopF失活的Caspase-8导致焦亡和凋亡受到抑制，但促进了坏死性凋亡。同时给予AR-12（PDK1抑制剂）和BI-D1870（RSK抑制剂）有可能克服Caspase-8的阻断并逆转SopF引起的PANoptosis。总之，这些发现表明SopF引发的这种毒力策略通过PDK1-RSK信号调节IECs的PANoptosis从而加重全身感染，这揭示了细菌效应蛋白的新功能，以及病原体对抗宿主免疫防御的机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SopF是否以及如何通过调控IECs的PANoptosis来影响S. Typhimurium的全身感染？
- 核心机制
- SopF通过激活PDK1-RSK信号通路抑制Caspase-8的激活，从而抑制焦亡和凋亡，促进坏死性凋亡，调控IECs的PANoptosis。
- 主要证据
- 链霉素预处理小鼠模型显示SopF抑制肠道炎症、减少IECs脱落并促进细菌扩散；Western blot显示SopF降低Caspase-8裂解、GSDMD/GSDME和Caspase-3活性，增加MLKL磷酸化；免疫沉淀显示SopF不与PDK1直接结合；PDK1和RSK抑制剂可逆转SopF对Caspase-8和PANoptosis的影响。
- 研究意义
- 揭示细菌效应蛋白SopF通过调控IECs PANoptosis加重全身感染的新机制，为控制S. Typhimurium感染和其他相关疾病提供潜在治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
IECs脱落与细菌分布观察
探究SopF对IECs脱落和S. Typhimurium在肠黏膜中分布的影响。
通过免疫荧光染色检测EpCAM和S. Typhimurium，透射电镜观察肠上皮超微结构，计数上皮缺口数量、IECs数量以及黏膜和黏膜下细菌数量。
IECs PANoptosis检测
验证SopF对IECs焦亡、凋亡和坏死性凋亡的调控作用。
在小鼠和细胞模型中检测LDH释放，分离IECs或细胞裂解物，通过Western blot检测GSDMD、GSDME、Caspase-3和pMLKL的表达水平。
Caspase-8激活检测
探究SopF是否抑制Caspase-8的激活，作为PANoptosis的分子开关。
通过Western blot检测小鼠IECs和感染细胞中pro-Caspase-8和cleaved Caspase-8的水平。
PDK1-RSK信号通路验证
确定SopF通过PDK1-RSK信号通路抑制Caspase-8的激活。
通过Western blot检测PDK1和pRSK水平；通过免疫沉淀检测SopF与PDK1的相互作用；使用PDK1抑制剂AR-12和RSK抑制剂BI-D1870预处理细胞，观察对Caspase-8和PANoptosis标志物的影响。
自噬通路排除
验证SopF对Caspase-8的抑制是否依赖于自噬通路。
使用V-ATPase抑制剂Bafilomycin A1预处理细胞，检测Caspase-8激活和LC3-II积累情况。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细菌培养 | LB肉汤 | Hangwei | -- |
| 卡那霉素 | Yeasen | -- | |
| L-阿拉伯糖 | Sigma | -- | |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | HyClone | -- |
| DMEM培养基 | HyClone | -- | |
| 胎牛血清 | Biological Industries | -- | |
| 链霉素 | Sigma | -- | |
| 组织学 | 光学显微镜 | Olympus | -- |
| Triton | Sigma | -- | |
| 细菌载量测定 | 沙门氏菌-志贺氏菌琼脂 | Hangwei | -- |
| 免疫荧光 | EpCAM抗体 | Servicebio | GB11274 |
| 抗沙门氏菌O抗原抗体 | Lanzhou Institute of Biological Products | S10820100 | |
| Cy3标记山羊抗兔IgG | Servicebio | GB21303 | |
| Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG | Servicebio | GB25303 | |
| DAPI | Servicebio | G1012 | |
| 抗荧光淬灭封片剂 | Servicebio | G1401 | |
| 尼康显微镜 | Nikon | ECLIPSE, | |
| 电镜 | 透射电子显微镜 | Hitachi | HT7700 |
| 细胞感染 | 阿米卡星 | MilliporeSigma | -- |
| 抑制剂处理 | AR-12 | Selleck | S1106 |
| BI-D1870 | MCE | HY-10510 | |
| 巴佛洛霉素A1 | Abcam | ab120497 | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Beyotime Biotechnology | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| 磷酸酶抑制剂 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| LDH检测 | LDH释放检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- |
| Infinite F50酶标仪 | Tecan | -- | |
| 转染 | ExFect转染试剂 | Vazyme | -- |
| 免疫沉淀 | 蛋白A/G PLUS-琼脂糖 | Santa Cruz Biotechnology | -- |
| His标签单克隆抗体 | proteintech | 66005-1-Ig | |
| Western blot | PVDF膜 | MilliporeSigma | -- |
| 脱脂奶粉 | Sangon Biotech | -- | |
| ECL发光液 | Meilunbio | -- | |
| 裂解型Caspase-8抗体 | Cell Signaling Technology | 8592 | |
| Caspase-8抗体 | Beyotime | AC056 | |
| 磷酸化RSK2抗体 | Cell Signaling Technology | 3556S | |
| PDK1抗体 | Cell Signaling Technology | 5662S | |
| Caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 14220S | |
| Caspase-1抗体 | Cell Signaling Technology | 3866S | |
| 抗磷酸化MLKL(S345)抗体 | Abcam | ab196436 | |
| 抗磷酸化MLKL(S358)抗体 | Abcam | ab187091 | |
| 抗Caspase-1前体+p10+p12抗体 | Abcam | ab179515 | |
| 抗GSDMD抗体 | Abcam | ab209845 | |
| 抗GSDMD抗体 | Abcam | ab225867 | |
| 抗GSDMD N端裂解片段抗体 | Abcam | ab215203 | |
| β-actin抗体 | Bioss | bs-0061 | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Beyotime Biotechnology | -- |
| All-in-one RT MasterMix试剂盒 | Applied Biological Materials | -- | |
| EvaGreen MasterMix-Low ROX | Applied Biological Materials | -- | |
| ViiA7实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细菌菌株和培养 | 菌株类型：STM-WT、STM-ΔsopF、STM-ΔsopF/psopF、STM-ΔsopF/pBAD、STM-ΔsopF/psopF:His；培养条件：LB肉汤，37°C，220rpm；抗生素浓度：卡那霉素50μg/ml，氨苄青霉素100μg/ml；阿拉伯糖诱导浓度：0.2% 阅读提示：详见Materials and methods中的Bacterial strains and culture conditions |
| 细胞培养和感染 | 细胞系：Caco-2、NCM460；培养条件：DMEM或RPMI1640+10%FBS，37°C，5%CO2；感染MOI=100；感染后1h换含100μg/ml阿米卡星的培养基，2h后换含10μg/ml阿米卡星的培养基 阅读提示：详见Materials and methods中的Cell culture和S. Typhimurium infection in vitro |
| 小鼠感染模型 | 小鼠品系：C57BL/6，雌性，6-8周龄；链霉素预处理：100μl的200mg/ml链霉素灌胃；感染剂量：5×10^7 CFU，口服灌胃；观察时间点：12、48、120 hpi 阅读提示：详见Materials and methods中的S. typhimurium infection in vivo and ethics statement |
| 抑制剂处理 | PDK1抑制剂AR-12浓度1μM，RSK抑制剂BI-D1870浓度10μM，均感染前1h预处理；Bafilomycin A1浓度100nM，感染前2h预处理 阅读提示：详见Materials and methods中的S. Typhimurium infection in vitro |
| Western blot | 抗体信息：裂解型Caspase-8 (#8592, CST)、Caspase-8 (AC056, Beyotime)、pRSK2 (#3556S, CST)、PDK1 (#5662S, CST)、Caspase-3 (#14220S, CST)、Caspase-1 (#3866S, CST)、pMLKL (ab196436/ab187091, Abcam)、GSDMD (ab209845/ab225867, Abcam)、cleaved GSDMD (ab215203, Abcam)、β-actin (bs-0061R, Bioss) 阅读提示：详见Materials and methods中的Western blot analysis |
| LDH释放检测 | 细胞接种密度4×10^5/孔；感染后检测时间点：2、8、16、24 hpi；检测波长490nm 阅读提示：详见Materials and methods中的Lactate dehydrogenase (LDH) release assay |
| 免疫沉淀 | 感染MOI=100，时间点2hpi和24hpi；His抗体(66005-1-Ig, proteintech)；蛋白A/G琼脂糖 阅读提示：详见Materials and methods中的Immunoprecipitation |