建立断奶仔猪腹泻模型
筛选腹泻和健康仔猪，为后续研究提供动物模型。
选取60头断奶仔猪，根据腹泻评分分为腹泻组（评分4或5持续3天）和健康组（评分1或2持续3天），并采集粪便和结肠样本。
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microRNA缺失导致肠道菌群产生的琥珀酸积累，进而引起断奶仔猪腹泻
Intestinal accumulation of microbiota-produced succinate caused by loss of microRNAs leads to diarrhea in weanling piglets
实验完整度
高包含高、中、低三个证据层级：体内猪模型、小鼠模型、体外细胞实验、单细胞RNA测序、宏基因组与代谢组分析，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
断奶仔猪（腹泻模型） 小鼠（粪菌移植及miRNA干预模型） IPEC-J2细胞系 RAW264.7细胞系
重点核对
仔猪样本量：健康组n=11，腹泻组n=13 琥珀酸处理剂量：直肠给予2 mg/天 miRNA antagomir/agomir处理剂量：尾静脉注射50 mg/kg，隔天一次 细胞处理：IPEC-J2细胞用20 mM琥珀酸二钠处理24小时；RAW264.7细胞用50 mM琥珀酸二钠处理24小时 TLR4抑制剂TAK-242预处理浓度：1 μM，30分钟
摘要
腹泻病是一种病因复杂的常见健康问题。尽管腹泻伴有微生物多样性的紊乱，但肠道微生物如何参与腹泻的发生仍很大程度上未知。本研究利用断奶应激诱导的猪腹泻模型，旨在阐明并丰富腹泻的机制基础。我们发现，腹泻仔猪的粪便微生物组、代谢物及microRNA水平均发生显著改变。具体而言，ssc-miRNA-425-5p和ssc-miRNA-423-3p的缺失（二者抑制普雷沃氏菌属中延胡索酸还原酶（frd）的基因表达）导致仔猪体内琥珀酸积累，从而引发腹泻。单细胞RNA测序表明，腹泻仔猪结肠上皮功能受损，免疫反应增强。值得注意的是，积累的琥珀酸通过调节上皮细胞中的跨上皮Cl-分泌增加结肠液体分泌。同时，琥珀酸通过激活巨噬细胞中MyD88依赖的TLR4信号传导促进结肠炎症反应。总之，我们的发现扩展了腹泻的机制基础，并提示microRNA缺失导致肠道菌群产生的琥珀酸在结肠积累，进而导致断奶仔猪腹泻。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肠道微生物及其代谢物如何参与断奶仔猪腹泻的发生，以及miRNA在其中发挥什么作用？
- 核心机制
- ssc-miRNA-425-5p和ssc-miRNA-423-3p的缺失导致普雷沃氏菌中延胡索酸还原酶（frd）基因表达升高，从而增加琥珀酸的产生。积累的琥珀酸通过增加结肠上皮Cl-分泌促进液体分泌，并通过激活巨噬细胞中MyD88依赖的TLR4信号促进炎症，最终导致腹泻。
- 主要证据
- 断奶仔猪模型显示腹泻个体中两种miRNA减少，琥珀酸水平升高；体外发酵实验和体外细胞实验证实miRNA抑制frd基因表达及琥珀酸产生，琥珀酸增加上皮Cl-分泌和巨噬细胞炎症因子分泌；小鼠模型验证了miRNA干预对腹泻和琥珀酸水平的影响。
- 研究意义
- 本研究扩展了腹泻的机制基础，为腹泻的预防或治疗提供了潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估肠道形态和炎症
检查腹泻仔猪结肠组织学变化和炎症状态。
采用HE染色和透射电镜观察结肠形态，检测TNF-α浓度、F4/80蛋白表达和紧密连接蛋白表达。
分析肠道菌群和代谢物
比较腹泻和健康仔猪粪便菌群组成和代谢物差异。
通过宏基因组测序和Untargeted代谢组学分析粪便样本，并通过qPCR验证普雷沃氏菌丰度，以及琥珀酸和谷氨酸含量。
验证琥珀酸诱导腹泻
检验琥珀酸积累是否直接导致腹泻。
对健康仔猪进行直肠给予琥珀酸或谷氨酸（2 mg/天），观察腹泻情况；对腹泻仔猪进行FMT和热灭活FMT，检测粪便中琥珀酸浓度。
验证miRNA调控琥珀酸产生
测试miRNA-425-5p和miRNA-423-3p是否抑制普雷沃氏菌中frd基因表达和琥珀酸产生。
体外发酵实验添加miRNA mimics，检测琥珀酸含量和frd基因表达；小鼠模型使用antagomir和agomir干预，评估腹泻和琥珀酸水平。
单细胞测序分析结肠细胞异质性
表征腹泻状态下结肠细胞类型和基因表达变化。
使用scRNA-seq对腹泻和健康仔猪结肠组织进行测序，分析细胞类型和差异表达基因，特别是上皮细胞中的ANO9、CLCA1和免疫细胞中的IRF1、IRF7、TNF。
验证琥珀酸促进上皮分泌和巨噬细胞炎症
验证琥珀酸对上皮Cl-分泌和巨噬细胞炎症信号通路的影响。
体外培养IPEC-J2和RAW264.7细胞，用琥珀酸二钠处理，检测AN09、CLCA1、NHE3、DRA蛋白表达，以及TLR4/MyD88/IRF1/IRF7表达和TNF-α、IL-1β分泌，并使用TAK-242阻断TLR4验证通路。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 粪菌移植 | 无菌甘油 | Aladdin | G116208 |
| 断奶仔猪饲料添加 | 琥珀酸 | Acros | C15873 |
| 谷氨酸 | Acros | D304062 | |
| 组织固定 | 甲醛 | Aladdin | F111941 |
| 免疫组化封闭 | 牛血清白蛋白 | Pierce | 23210 |
| 免疫组化 | F4/80抗体 | Bioss | bsm-34028M |
| 免疫组化封片 | 中性树胶 | Aladdin | N116470 |
| 宏基因组测序DNA提取 | E.Z.N.A.®粪便DNA提取试剂盒 | Omega | D4015-02 |
| 宏基因组测序文库构建 | TruSeq Nano DNA LT文库制备试剂盒 | Illumina | FC-121-4001 |
| 宏基因组测序DNA片段化 | dsDNA片段化酶 | NEB | M0348S |
| qPCR | QIAamp快速粪便DNA小提试剂盒 | QIAGEN | 51604 |
| 通用PCR预混液 | Applied Biosystems | 4304437 | |
| 琥珀酸和谷氨酸检测 | 琥珀酸比色法检测试剂盒 | Merck | MAK184 |
| 谷氨酸比色法检测试剂盒 | Merck | MAK330 | |
| 小RNA测序文库构建 | 多重小RNA文库制备试剂盒 | NEBNext | -- |
| 小RNA测序PCR扩增 | LongAmp Taq 2×预混液 | NEB | M0287L |
| 小RNA测序质量控制 | Agilent Bioanalyzer 2100系统 | Agilent | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 10296010 |
| cDNA合成 | cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | 4374966 |
| miRNA处理 | miRNA-425-5p激动剂 | Sangon Biotech | -- |
| miRNA-423-3p激动剂 | Sangon Biotech | -- | |
| miRNA-425-5p拮抗剂 | Sangon Biotech | -- | |
| miRNA-423-3p拮抗剂 | Sangon Biotech | -- | |
| 抗生素处理 | 甲硝唑 | Supelco | M3761 |
| 新霉素 | Sigma-Aldrich | N6386 | |
| 万古霉素 | Sigma-Aldrich | V2002 | |
| 链霉素 | Supelco | 85886 | |
| miRNA表达检测 | miRNA cDNA合成试剂盒 | Applied Biosystems | A28007 |
| Fast预混液和Advanced miRNA测定试剂 | ThermoFisher | A25576 | |
| MeRIP | GenElute mRNA小提试剂盒 | Sigma-Aldrich | MRN70 |
| riboMeRIP™ m6A转录组分析试剂盒 | RiboBio | C11051-1 | |
| 单细胞RNA测序 | 10X Genomics Chromium单细胞3'试剂盒（V3） | 10X Genomics | 1000269 |
| RT-qPCR | PrimeScript RT试剂盒 | Takara | RR037A |
| qPCR预混液 | ThermoFisher | K0252 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11320033 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 细胞处理 | 琥珀酸二钠 | Sigma-Aldrich | S2378 |
| TAK-242（瑞沙托维） | Selleck | S7455 | |
| 蛋白质定量 | Wes Simple Western系统 | ProteinSimple | -- |
| ZO-1抗体 | Abcam | ab190085 | |
| Claudin-1抗体 | Abcam | ab180158 | |
| Occludin抗体 | Abcam | ab216327 | |
| F4/80抗体 | Bioss | bsm-34028M | |
| ANO9抗体 | Abcepta | ABV11856 | |
| CLAC1抗体 | GeneTex | GTX66323 | |
| SUCNR1抗体 | Abcam | ab75105 | |
| TLR4抗体 | Abcam | ab22048 | |
| MyD88抗体 | Abcam | ab28763 | |
| IRF1抗体 | Abcam | ab230652 | |
| IRF7抗体 | Bioss | bs-2994R | |
| 氯离子浓度检测 | 氯离子浓度检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | MAK023 |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000 | ThermoFisher | L3000015 |
| miRNA模拟物 | Sangon Biotech | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 仔猪模型建立 | 仔猪品种、断奶日龄、腹泻评分标准、分组样本量 阅读提示：Materials and methods: Experiments for the selection of healthy and diarrheal piglets |
| 粪菌移植 | 粪菌悬液浓度（108 CFU/mL）、体积（2 mL）、给药方式、给药频率、仔猪分组 阅读提示：Materials and methods: Fecal microbiota transplantation (FMT) experiments |
| 琥珀酸处理 | 琥珀酸剂量（2 mg/天）、给药途径（直肠）、处理时间（7天） 阅读提示：Materials and methods: Succinate or glutamate treatment experiments in piglets |
| miRNA体内处理 | miRNA agomir/antagomir剂量（50 mg/kg）、给药途径（尾静脉注射）、频率（隔天一次）、处理时长 阅读提示：Materials and methods: In vivo miRNA treatment |
| 细胞实验 | 细胞系、培养条件、琥珀酸浓度和处理时间 阅读提示：Materials and methods: In vitro succinate treatment |
| 单细胞RNA测序 | 样本来源、细胞数量、测序平台、分析流程 阅读提示：Materials and methods: Single‐cell RNA sequencing |