临床试验设计与患者入组
评估联合辅助治疗的临床疗效和安全性。
开展前瞻性、单臂、II期临床试验，入组43例完全切除的III期黑色素瘤患者，给予特瑞普利单抗和rh-endostatin联合辅助治疗，并进行随访和不良事件记录。
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重组人内皮抑素联合特瑞普利单抗（抗PD-1）辅助治疗局部晚期黑色素瘤：一项结合单细胞RNA/TCR/BCR测序的探索性2期临床试验
Adjuvant recombinant human endostatin combined with toripalimab (anti-PD-1) in locally advanced melanoma: an exploratory phase 2 clinical trial incorporating single-cell RNA/TCR/BCR sequencing
实验完整度
高包含前瞻性II期临床试验、单细胞转录组及TCR/BCR测序、两个独立真实世界队列验证，涵盖临床疗效、安全性与免疫机制多层级验证。
主要模型
43例完全切除的III期黑色素瘤患者 外周血单个核细胞（PBMC） 真实世界队列1（384例III期黑色素瘤患者） 真实世界队列2（47例III期黑色素瘤患者）
重点核对
给药方案：特瑞普利单抗3 mg/kg静脉注射，每2周一次，最多13个周期 给药方案：rh-endostatin（Endostar）210 mg，每个4周周期的第1-3天静脉注射，最多6个周期 单细胞测序配对样本：治疗前1天和第一周期完成后的第1天采集外周血（约10 mL） CD8+Tem流式鉴定标记物：CD3+CD8+CCR7−CD45RA− NLR最佳截断值：1.6（通过X-Tile确定）
摘要
目的：在东亚，黑色素瘤主要以肢端雀斑样亚型为主，其次为皮肤亚型。东亚地区完全切除的III期或IV期黑色素瘤患者疾病复发风险高。PD-1抑制剂单药辅助治疗在该患者群体中的疗效仍然有限，凸显了联合策略的必要性。患者与方法：这项前瞻性、单臂、II期试验（NCT05907512）旨在研究重组人内皮抑素（rh-endostatin，一种血管生成抑制剂）联合特瑞普利单抗（一种PD-1抑制剂）辅助治疗可切除的III期至寡转移IV期黑色素瘤中国患者。主要终点是1年无复发生存期（RFS）。收集联合辅助治疗前后的配对外周血样本，用于单细胞RNA测序、TCR/BCR测序和生物标志物鉴定。评估了两个独立的真实世界局部晚期黑色素瘤患者队列以验证生物标志物。结果：前瞻性入组了43例符合条件的切除后III期黑色素瘤患者。没有入组切除后寡转移IV期疾病患者。患者的1年RFS为74.4%，中位RFS为27个月（95%置信区间：19，未达到）。贫血（12/43，27.9%）、肝酶升高（11/43，25.6%）和甲状腺功能障碍（9/43，20.9%）是最常见的三种治疗相关不良事件。联合辅助治疗扩大了患者外周总T细胞和NK细胞，增加了循环CD8+Tem和Teff细胞及其TCR克隆多样性，提高了B细胞的抗原呈递能力，提高了BCR克隆多样性，并增加了非经典单核细胞的数量及其抗原呈递能力。中性粒细胞与淋巴细胞比率和循环CD8+Tem细胞在独立的真实世界队列中被支持为与结局相关的候选生物标志物。结论：辅助性rh-endostatin联合特瑞普利单抗在中国切除后局部晚期黑色素瘤患者中显示出令人鼓舞的临床活性，并可能与潜在的生存获益相关。不良反应可控。外周T细胞、NK细胞、B细胞和单核细胞亚群的数量增加和功能变化为免疫治疗的优化提供了机制见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在中国完全切除的III期或寡转移IV期黑色素瘤患者中，辅助性重组人内皮抑素联合特瑞普利单抗是否能降低复发风险并改善生存，同时识别潜在的预后生物标志物？
- 核心机制
- 联合辅助治疗可能通过多种互补机制增强抗肿瘤免疫，包括增加外周总T细胞和NK细胞数量、提高CD8+Tem和Teff细胞及其TCR克隆多样性、增强B细胞抗原呈递能力和BCR克隆多样性、增加非经典单核细胞数量及其抗原呈递能力，并增强髓系细胞与CD8+T细胞亚群间的相互作用。
- 主要证据
- 来自43例患者的1年RFS为74.4%，中位RFS为27个月；单细胞测序分析显示治疗前后外周血免疫细胞组成和功能发生上述变化；两个独立真实世界队列验证了NLR和CD8+Tem作为预后生物标志物的价值。
- 研究意义
- 该联合辅助治疗方案显示临床活性且不良反应可控，为亚洲局部晚期黑色素瘤患者的术后辅助治疗提供了新的策略，并为优化免疫治疗提供了机制见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
外周血单细胞转录组及免疫组库测序
解析联合辅助治疗对外周血免疫细胞组成和功能的影响。
采集7例患者治疗前后的配对外周血，分离PBMC，进行scRNA-seq、scTCR-seq和scBCR-seq测序，并进行细胞类型注释、差异表达基因分析、通路富集、轨迹分析、TCR/BCR克隆多样性和细胞通讯分析。
T细胞和NK细胞亚群分析
评估联合辅助治疗对T和NK细胞亚群比例、功能状态及分化轨迹的影响。
对29,426个T和NK细胞进行亚群鉴定，分析治疗前后各亚群比例变化、ISG表达和细胞毒性评分，并进行拟时间轨迹和RNA velocity分析。
TCR和BCR库动态分析
评估联合辅助治疗对TCR和BCR克隆多样性和克隆扩增的影响。
基于单细胞VDJ数据，分析治疗前后TCR和BCR克隆型频率分布、多样性指数（Chao1、D50等）、共享克隆型数量以及V(D)J基因使用频率。
B细胞亚群和单核细胞亚群分析
评估联合辅助治疗对B细胞和单核细胞亚群比例及抗原呈递能力的影响。
对B细胞和单核吞噬细胞系统进行亚群鉴定，分析治疗前后各亚群比例变化和抗原呈递评分。
细胞通讯分析
评估联合辅助治疗对免疫细胞间配体-受体相互作用的影响。
使用CellphoneDB预测治疗前后各细胞类型间的配体-受体相互作用，比较相互作用数量和特定信号通路的变化。
真实世界队列验证
验证NLR和循环CD8+Tem作为预后生物标志物的价值。
建立两个独立真实世界队列，分别回顾性分析384例和47例III期黑色素瘤患者，通过Kaplan-Meier分析和Cox回归评估NLR和CD8+Tem水平与RFS和MSS的关系。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
差异表达和通路分析
细胞通讯分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 单细胞测序 | GEXSCOPE®单细胞人类V(D)J试剂盒 | Singleron Biotechnologies | -- |
| Illumina HiSeq X测序仪 | Illumina | -- | |
| 流式细胞术 | CD3+ CD8+ CCR7− CD45RA− | -- | -- |
| 治疗药物 | 特瑞普利单抗 | -- | -- |
| 重组人内皮抑素（恩度） | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者入组与治疗 | 入组标准：18岁及以上，ECOG 0-1，完全切除的III期或寡转移IV期肢端或皮肤黑色素瘤；给药方案：特瑞普利单抗3 mg/kg静脉注射每2周一次，rh-endostatin 210 mg每个周期第1-3天静脉注射 阅读提示：Methods: Trial design, participants and sample size; Treatment, follow-up and endpoints |
| 样本采集与测序 | 配对血样采集时间点（治疗前1天和第一周期后第1天）；PBMC分离方法；单细胞悬液浓度1×10⁵ cells/mL；测序平台和读长 阅读提示：Methods: Sample collection, sequencing, and library construction |
| 单细胞数据处理 | 质量控制阈值：基因数<200或前2%排除，UMI前2%排除，线粒体基因>10%排除；聚类参数：Louvain分辨率1.2，top 15 PCs 阅读提示：Methods: Quality control and dimensionality reduction for scRNA-seq data |
| TCR/BCR分析 | TCR克隆型定义（独特的TRA-TRB对），BCR克隆型定义（独特的IGH-IGK/IGL对）；克隆型频率分类阈值（Single=1，Medium=2-10，Large>10） 阅读提示：Methods: TCR and BCR analysis |
| 真实世界队列验证 | 队列1：384例完全切除的III期黑色素瘤患者，NLR最佳截断值1.6；队列2：47例，CD8+Tem的中位截断值40.7% 阅读提示：Methods: Real-world melanoma cohorts for validation |