山药薯蓣根茎减轻哮喘中的气道重塑和血管生成相关变化,并改变mTOR/4EBP1/HIF-1α/VEGF通路标志物

Rhizoma Dioscoreae Nipponicae attenuates airway remodeling and angiogenesis-related changes in asthma with altered mTOR/4EBP1/HIF-1α/VEGF pathway markers

作者信息Xiaoqing Zhou, Zhen Wang, Suqun Zheng
PMID42256024
发布时间2026-05-30
DOI10.1016/j.waojou.2026.101412

实验完整度

包含体内小鼠哮喘模型、体外内皮细胞实验、组织病理学染色、qPCR和Western blot等多层次验证,且包含阳性药物对照和机制探索。

主要模型

卵清蛋白诱导的BALB/c小鼠哮喘模型 C166小鼠内皮细胞

重点核对

哮喘模型的建立:OVA致敏和激发方案(腹腔注射50μg OVA,雾化5mg/mL OVA) 给药剂量:RDN 10g/kg/天,泼尼松5mg/kg/天,灌胃14天 C166细胞分组:MHY1485 (2μM)刺激模型,RDN含药血清(5%)处理,雷帕霉素(20nM)对照 炎症评分和胶原面积比的定量方法(ImageJ分析) 蛋白质表达分析:Western blot,β-actin作为内参

摘要

背景:哮喘是一种慢性炎症性气道疾病,以气道重塑和高反应性为特征。血管生成是气道重塑和疾病进展的关键因素。山药薯蓣根茎(RDN),一种传统中药,已显示出抗炎和抗血管生成的潜力,但其对哮喘相关气道重塑的影响尚不清楚。方法:使用UHPLC-Q Exactive Orbitrap MS/MS表征RDN提取物的化学特征。使用卵清蛋白诱导的小鼠哮喘模型和C166小鼠内皮细胞研究RDN治疗的效果。通过H&E和Masson三联染色评估组织病理学变化。通过qPCR和Western blot分析mTOR/4EBP1/HIF-1α/VEGF信号通路关键组分的mRNA和蛋白表达水平。结果:UHPLC-Q Exactive Orbitrap MS/MS分析初步注释了2509种成分,并显示出RDN提取物批次间良好的化学一致性。与模型组相比,RDN治疗显著降低了气道炎症评分约39.5%(P < 0.01),效果与泼尼松相当。它还使胶原面积比减少约62.7%(P < 0.05)。RDN还显著降低了肺组织和C166细胞中mTOR、4EBP1、HIF-1α和VEGF的蛋白水平(P < 0.05)。结论:RDN在组织病理学水平上减轻了气道炎症和重塑,这些效应与mTOR/4EBP1/HIF-1α/VEGF通路内标志物的下调相关。这些发现表明RDN可能是改善哮喘气道重塑的有前景的治疗剂。未来纳入磷酸化状态分析的研究将有助于进一步阐明潜在机制。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
RDN是否能减轻哮喘中的气道重塑和血管生成,其机制是否涉及mTOR/4EBP1/HIF-1α/VEGF通路?
核心机制
RDN可能通过下调mTOR/4EBP1/HIF-1α/VEGF信号通路标志物,从而减轻气道炎症和重塑。
主要证据
在OVA诱导的小鼠哮喘模型中,RDN显著降低气道炎症评分和胶原沉积,并下调肺组织中mTOR、4EBP1、HIF-1α和VEGF的mRNA和蛋白水平。在C166内皮细胞中,RDN可抑制MHY1485诱导的该通路激活。
研究意义
研究表明RDN可能是改善哮喘气道重塑和血管生成相关变化的候选治疗剂,为传统中药治疗哮喘提供了科学依据。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

RDN提取物制备与化学表征

确认RDN提取物的化学成分和批次一致性。

制备RDN水提物,使用UHPLC-Q Exactive Orbitrap MS/MS分析化学轮廓,并进行批次间一致性评估。

2

建立OVA诱导的小鼠哮喘模型并给药

建立哮喘动物模型,评估RDN治疗的体内效果。

使用BALB/c小鼠,通过OVA致敏和激发建立哮喘模型,分为对照组、模型组、模型+RDN组、模型+泼尼松组,通过灌胃给药。

3

组织病理学评估

评估RDN对哮喘小鼠肺组织炎症和胶原沉积的影响。

通过H&E染色评估炎症细胞浸润,Masson三色染色评估胶原沉积。

4

肺组织mRNA表达分析

检测mTOR/4EBP1/HIF-1α/VEGF通路相关基因在肺组织中的表达变化。

提取肺组织RNA,通过RT-qPCR检测Raptor、mTOR、4EBP1、EIF4E、HIF-1α、VEGF的mRNA表达。

5

肺组织蛋白表达分析

验证mTOR/4EBP1/HIF-1α/VEGF通路蛋白在肺组织中的表达变化。

通过Western blot检测Raptor、mTOR、4EBP1、eIF4E、HIF-1α、VEGF的蛋白水平。

6

C166细胞培养与处理

探讨RDN在细胞水平对mTOR通路的影响。

培养C166小鼠内皮细胞,分组处理:对照、MHY1485刺激、MHY1485+RDN含药血清、雷帕霉素、RDN含药血清。

7

C166细胞mRNA和蛋白表达分析

检测C166细胞中mTOR通路相关基因和蛋白的表达水平。

收集处理后的C166细胞,分别提取RNA和蛋白质,通过RT-qPCR和Western blot检测通路组分。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱----
赛默飞UltiMate 3000超高效液相色谱系统Thermo Fisher Scientific--
Q Exactive质谱仪Thermo Fisher Scientific--
伊红溶液(G1100)SolarbioG1100
Masson三色染色试剂盒(G1006)ServicebioG1006
超纯总RNA提取试剂盒(5003050)Xinjing Biotech5003050
All-in-One第一链cDNA合成试剂盒(7316050)Xinjing Biotech7316050
QuantFast SYBR Green qPCR超混物(M221)Maibo BiotechM221
CFX96实时荧光定量PCR检测系统----
NanoDrop微量分光光度计Thermo Fisher Scientific--
T-PER组织蛋白提取试剂(78510)Thermo Fisher Scientific78510
BCA蛋白定量试剂盒(P0010)BeyotimeP0010
PVDF膜(IPVH00010)MilliporeIPVH00010
Raptor抗体(2280)Cell Signaling Technology2280
mTOR抗体(2983)Cell Signaling Technology2983
4EBP1抗体(9644)Cell Signaling Technology9644
eIF4E抗体(2067)Cell Signaling Technology2067
β-actin抗体(ab8226)Abcamab8226
VEGFA抗体(ab214424)Abcamab214424
HIF-1α抗体(14179)Abcam14179
山羊抗小鼠IgG(31160)Thermo Fisher Scientific31160
山羊抗兔IgG(31210)Thermo Fisher Scientific31210
ECL化学发光试剂Thermo Fisher Scientific--
MHY1485(mTOR激活剂)SelleckSML0810
雷帕霉素(mTOR抑制剂)SelleckS1039
CCK-8细胞活力检测试剂盒----

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物模型建立
OVA致敏剂量(50μg/只,腹腔注射)、激发浓度(5mg/mL雾化)、时间(第15天起14天)
阅读提示:Methods: Establishment of the mouse model and treatments
给药方案
RDN给药剂量(10g/kg/d)、泼尼松剂量(5mg/kg/d)、给药途径(灌胃)、疗程(14天)
阅读提示:Methods: Establishment of the mouse model and treatments
组织病理学分析
炎症评分标准(5分制)、胶原面积比计算方式(ImageJ)
阅读提示:Methods: H&E staining, Masson's trichrome staining; Figure legends 2和3
分子表达分析
内参基因(β-actin)、抗体信息(货号及品牌)、qPCR条件(SYBR Green)
阅读提示:Methods: RT-qPCR, Western blot; Figure legends 4和5
C166细胞实验
细胞系来源、培养条件(DMEM+10%FBS)、MHY1485浓度(2μM)、RDN含药血清浓度(5%)、雷帕霉素浓度(20nM)、处理时间(48小时)
阅读提示:Methods: Preliminary optimization, Experimental grouping and treatment of C166 cells