RDN提取物制备与化学表征
确认RDN提取物的化学成分和批次一致性。
制备RDN水提物,使用UHPLC-Q Exactive Orbitrap MS/MS分析化学轮廓,并进行批次间一致性评估。
Rhizoma Dioscoreae Nipponicae attenuates airway remodeling and angiogenesis-related changes in asthma with altered mTOR/4EBP1/HIF-1α/VEGF pathway markers
包含体内小鼠哮喘模型、体外内皮细胞实验、组织病理学染色、qPCR和Western blot等多层次验证,且包含阳性药物对照和机制探索。
卵清蛋白诱导的BALB/c小鼠哮喘模型 C166小鼠内皮细胞
哮喘模型的建立:OVA致敏和激发方案(腹腔注射50μg OVA,雾化5mg/mL OVA) 给药剂量:RDN 10g/kg/天,泼尼松5mg/kg/天,灌胃14天 C166细胞分组:MHY1485 (2μM)刺激模型,RDN含药血清(5%)处理,雷帕霉素(20nM)对照 炎症评分和胶原面积比的定量方法(ImageJ分析) 蛋白质表达分析:Western blot,β-actin作为内参
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确认RDN提取物的化学成分和批次一致性。
制备RDN水提物,使用UHPLC-Q Exactive Orbitrap MS/MS分析化学轮廓,并进行批次间一致性评估。
建立哮喘动物模型,评估RDN治疗的体内效果。
使用BALB/c小鼠,通过OVA致敏和激发建立哮喘模型,分为对照组、模型组、模型+RDN组、模型+泼尼松组,通过灌胃给药。
评估RDN对哮喘小鼠肺组织炎症和胶原沉积的影响。
通过H&E染色评估炎症细胞浸润,Masson三色染色评估胶原沉积。
检测mTOR/4EBP1/HIF-1α/VEGF通路相关基因在肺组织中的表达变化。
提取肺组织RNA,通过RT-qPCR检测Raptor、mTOR、4EBP1、EIF4E、HIF-1α、VEGF的mRNA表达。
验证mTOR/4EBP1/HIF-1α/VEGF通路蛋白在肺组织中的表达变化。
通过Western blot检测Raptor、mTOR、4EBP1、eIF4E、HIF-1α、VEGF的蛋白水平。
探讨RDN在细胞水平对mTOR通路的影响。
培养C166小鼠内皮细胞,分组处理:对照、MHY1485刺激、MHY1485+RDN含药血清、雷帕霉素、RDN含药血清。
检测C166细胞中mTOR通路相关基因和蛋白的表达水平。
收集处理后的C166细胞,分别提取RNA和蛋白质,通过RT-qPCR和Western blot检测通路组分。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 化学分析 | ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱 | -- | -- |
| 赛默飞UltiMate 3000超高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Q Exactive质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 组织病理学 | 伊红溶液(G1100) | Solarbio | G1100 |
| Masson三色染色试剂盒(G1006) | Servicebio | G1006 | |
| 分子生物学 | 超纯总RNA提取试剂盒(5003050) | Xinjing Biotech | 5003050 |
| All-in-One第一链cDNA合成试剂盒(7316050) | Xinjing Biotech | 7316050 | |
| QuantFast SYBR Green qPCR超混物(M221) | Maibo Biotech | M221 | |
| CFX96实时荧光定量PCR检测系统 | -- | -- | |
| NanoDrop微量分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白分析 | T-PER组织蛋白提取试剂(78510) | Thermo Fisher Scientific | 78510 |
| BCA蛋白定量试剂盒(P0010) | Beyotime | P0010 | |
| PVDF膜(IPVH00010) | Millipore | IPVH00010 | |
| Raptor抗体(2280) | Cell Signaling Technology | 2280 | |
| mTOR抗体(2983) | Cell Signaling Technology | 2983 | |
| 4EBP1抗体(9644) | Cell Signaling Technology | 9644 | |
| eIF4E抗体(2067) | Cell Signaling Technology | 2067 | |
| β-actin抗体(ab8226) | Abcam | ab8226 | |
| VEGFA抗体(ab214424) | Abcam | ab214424 | |
| HIF-1α抗体(14179) | Abcam | 14179 | |
| 山羊抗小鼠IgG(31160) | Thermo Fisher Scientific | 31160 | |
| 山羊抗兔IgG(31210) | Thermo Fisher Scientific | 31210 | |
| ECL化学发光试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞实验 | MHY1485(mTOR激活剂) | Selleck | SML0810 |
| 雷帕霉素(mTOR抑制剂) | Selleck | S1039 | |
| CCK-8细胞活力检测试剂盒 | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | OVA致敏剂量(50μg/只,腹腔注射)、激发浓度(5mg/mL雾化)、时间(第15天起14天) 阅读提示:Methods: Establishment of the mouse model and treatments |
| 给药方案 | RDN给药剂量(10g/kg/d)、泼尼松剂量(5mg/kg/d)、给药途径(灌胃)、疗程(14天) 阅读提示:Methods: Establishment of the mouse model and treatments |
| 组织病理学分析 | 炎症评分标准(5分制)、胶原面积比计算方式(ImageJ) 阅读提示:Methods: H&E staining, Masson's trichrome staining; Figure legends 2和3 |
| 分子表达分析 | 内参基因(β-actin)、抗体信息(货号及品牌)、qPCR条件(SYBR Green) 阅读提示:Methods: RT-qPCR, Western blot; Figure legends 4和5 |
| C166细胞实验 | 细胞系来源、培养条件(DMEM+10%FBS)、MHY1485浓度(2μM)、RDN含药血清浓度(5%)、雷帕霉素浓度(20nM)、处理时间(48小时) 阅读提示:Methods: Preliminary optimization, Experimental grouping and treatment of C166 cells |