筛选阻断NET-DNA与CCDC25相互作用的小分子化合物
鉴定能够有效阻断NET-DNA与CCDC25结合的小分子化合物。
使用CCDC25包被的ELISA板筛选FDA批准的2217种药物，通过检测双链DNA荧光评估抑制率，鉴定出MTO为最有效的抑制剂。
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NET-DNA-CCDC25抑制剂di-Pal-MTO抑制肿瘤进展并促进先天免疫应答
The NET-DNA-CCDC25 inhibitor di-Pal-MTO suppresses tumor progression and promotes the innate immune response
实验完整度
高包含体外分子结合与细胞功能实验、分子动力学模拟、多种小鼠肿瘤模型（原位、转移、术后）及免疫微环境分析等多层级验证。
主要模型
MDA-MB-231人乳腺癌细胞系 4T1小鼠乳腺癌细胞系 EO771小鼠乳腺癌细胞系 BALB/c小鼠乳腺癌移植模型
重点核对
CCDC25氨基酸残基Y24、E25、D28对MTO结合的影响 di-Pal-MTO在细胞膜上的停留时间 di-Pal-MTO抑制NET诱导的RAC1-CDC42信号通路激活 di-Pal-MTO与PTX联合用药的抗肿瘤效果 DC耗竭或CXCR3中和对CD8+ T细胞浸润的影响
摘要
中性粒细胞胞外陷阱的DNA成分（NET-DNA）与癌症转移和化疗耐药相关。然而，近年来的研究表明，NET-DNA有助于树突状细胞（DCs）的活化，并促进抗肿瘤免疫的先天免疫应答。因此，探索在维持抗肿瘤免疫的同时抑制NET介导的肿瘤进展的治疗方法至关重要。我们团队近期鉴定出CCDC25是癌细胞质膜上特异性的NET-DNA传感器，可促进癌症转移。在本研究中，我们进行了小分子化合物筛选，并揭示米托蒽醌（MTO）能够阻断NET-DNA与CCDC25之间的相互作用。分子对接结果表明，MTO通过结合CCDC25晶体结构的酪氨酸24（Y24）、谷氨酸25（E25）和天冬氨酸28（D28）氨基酸残基与NET-DNA竞争。更重要的是，我们将MTO与棕榈油酸结合，如di-Pal-MTO，以增加其在细胞质膜上的停留时间，这提高了其抑制效率并降低了其细胞毒性。此外，di-Pal-MTO显著抑制RAC1-CDC42级联反应，以减轻NET诱导的细胞骨架重排和癌细胞的趋化迁移。在多个小鼠模型中，di-Pal-MTO可以抑制乳腺癌转移，并与化疗药物具有协同作用。此外，di-Pal-MTO促进NET-DNA依赖的DC活化，导致随后各种趋化因子的表达，促进CD8+ T细胞的浸润。总的来说，我们成功鉴定了一种小分子抑制剂di-Pal-MTO，它具有抑制肿瘤和抗肿瘤免疫反应的双重作用，为对抗乳腺癌提供了一种新的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否在不降解NET-DNA、保留其免疫刺激功能的前提下，通过阻断NET-DNA与CCDC25的相互作用来抑制肿瘤进展？
- 核心机制
- di-Pal-MTO通过竞争性结合CCDC25的Y24、E25和D28残基，阻断NET-DNA与CCDC25的相互作用，抑制下游RAC1-CDC42级联，减少细胞骨架重排和趋化迁移；同时保留NET-DNA诱导的DC活化，通过cGAS-STING途径促进CD8+ T细胞浸润。
- 主要证据
- 体外实验显示di-Pal-MTO抑制NET诱导的细胞骨架重排和迁移；多种小鼠模型（4T1肝转移、原位、术后复发）中，di-Pal-MTO单用或与PTX联用可抑制转移并延长生存期；免疫分析显示其增加DC成熟和CD8+ T细胞浸润，且DC耗竭或CXCR3中和可消除此效应。
- 研究意义
- 提供了一种新的靶向NET-CCDC25相互作用的治疗策略，通过小分子抑制剂在抑制肿瘤转移的同时维持抗肿瘤免疫，为乳腺癌治疗提供了新思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证MTO及其衍生物对NET-DNA-CCDC25结合的抑制作用
确认MTO及其衍生物（mono-Pal-MTO, di-Pal-MTO）能否有效抑制NET-DNA与CCDC25的结合。
通过分子对接、分子动力学模拟、SPR、pull-down和免疫荧光实验，验证MTO及其衍生物与CCDC25的结合及对NET-DNA结合的竞争性抑制。
评估MTO衍生物在细胞膜上的停留时间和细胞毒性
评估MTO衍生物是否具有更长的细胞膜停留时间和更低的细胞毒性。
通过共聚焦显微镜检测药物在细胞膜上的停留时间，通过CCK-8实验评估细胞毒性。
验证MTO衍生物对NET诱导的细胞功能的影响
验证MTO衍生物能否抑制NET诱导的细胞骨架重排和趋化迁移。
通过荧光染色和transwell迁移实验，检测NET刺激后细胞骨架和迁移能力的变化，并验证其依赖性。
评估MTO衍生物在体内对乳腺癌肝转移的抑制作用
评估MTO及其衍生物在体内对乳腺癌肝转移的抑制效果。
通过4T1小鼠脾内注射模型，比较不同剂量MTO、mono-Pal-MTO和di-Pal-MTO的治疗效果，并评估生存期和器官毒性。
评估di-Pal-MTO与PTX联合治疗的效果
评估di-Pal-MTO与化疗药物PTX联合治疗是否能增强抗肿瘤效果。
在4T1原位、Panc02皮下及术后复发模型中，比较PTX单药或与di-Pal-MTO、DNase I联合治疗的疗效。
验证di-Pal-MTO对NET-DNA诱导的DC活化及CD8+ T细胞浸润的影响
验证di-Pal-MTO是否能保留NET-DNA诱导的DC活化和CD8+ T细胞浸润。
通过流式细胞术和免疫荧光检测DC成熟标志物、趋化因子表达和CD8+ T细胞浸润，并评估DC耗竭或CXCR3中和的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | ATCC | -- | -- |
| CH3 Biosystems | -- | -- | |
| 重组蛋白表达 | pET28a表达载体 | Novagen | -- |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 | MedChemExpress | HY-15921 | |
| 蛋白纯化 | HisPur Ni-NTA纯化试剂盒 | Thermo Scientific | 88229 |
| NET提取 | 佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯 | Selleck | S7791 |
| NET-DNA纯化 | MicroElute DNA纯化试剂盒 | OMEGA | D6296 |
| 凋亡DNA提取 | 多西他赛 | -- | -- |
| 凋亡DNA纯化试剂盒 | Beyotime | C0008 | |
| CCDC25-NET-DNA结合实验 | Pierce™镍免疫探针板 | Thermo Fisher | 15342 |
| 双链DNA荧光定量试剂盒 | Thermo Scientific | P11495 | |
| 药物筛选 | FDA批准的药物库 | Selleck | L1300 |
| 细胞骨架染色 | Alexa Fluor 488 鬼笔环肽 | Invitrogen | A12379 |
| 细胞核染色 | Hoechst 33342 | Thermo Fisher | 62249 |
| 细胞成像 | 激光扫描共聚焦显微镜 (LSM800) | Zeiss | -- |
| 激光扫描共聚焦显微镜 (LSM880) | Zeiss | -- | |
| pull-down实验 | 细胞膜蛋白提取试剂盒 | Bestbio | BB-3103 |
| Biotin 3'末端DNA标记试剂盒 | Thermo Fisher | 89818 | |
| Dynabeads™ M-280链霉亲和素-琼脂糖磁珠 | Invitrogen | 11205D | |
| 免疫印迹 | 抗CCDC25一抗 | Proteintech | 21209-1-AP |
| HRP标记抗兔IgG (H+L) | Proteintech | SA00001-2 | |
| Syngene G:BOX化学发光成像系统 | Syngene | -- | |
| 细胞迁移 | Transwell小室 | Costar | -- |
| 细胞转染 | Opti-MEM培养基 | Gibco | 31985070 |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000015 | |
| 细胞活力测定 | 细胞计数试剂盒-8 (CCK-8) | Dojindo | -- |
| 酶标仪 | Thermo Fisher | -- | |
| 免疫荧光 | SYTOX™ Orange染料 | Invitrogen | S34861 |
| 抗H3Cit抗体 | Abcam | ab5103 | |
| 抗MPO抗体 | R&D | AF3667 | |
| 动物实验 | 4T1-luci细胞 | -- | -- |
| Panc02-luci细胞 | -- | -- | |
| 紫杉醇 (PTX) | -- | -- | |
| 脱氧核糖核酸酶I | -- | -- | |
| di-Pal-MTO | -- | -- | |
| IVIS Lumina成像系统 | Xenogen | -- | |
| 药代动力学分析 | 液相色谱-串联质谱 | -- | -- |
| T细胞杀伤实验 | 白细胞介素-4 | PeproTech | 214-14 |
| 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | PeproTech | 315-03 | |
| CD8微磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-116-478 | |
| 羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 | -- | -- | |
| 流式细胞仪 (Accuri C6 plus) | BD Biosciences | -- | |
| 组织染色 | 抗Ki-67抗体 | Abcam | ab16667 |
| 原位细胞死亡检测试剂盒 | KeyGEN BiOTECH | KGA7071 | |
| 血清指标检测 | 全自动生化分析仪 (HITACHI 3100) | HITACHI | -- |
| qRT-PCR | SYBR Green实时PCR预混液 | Takara | -- |
| ABI PRISM 7900序列检测系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | Thermo Fisher | 89901 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher | 87786 | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | HRP-60004 | |
| 抗β-actin抗体 | Proteintech | HRP-60008 | |
| RAC1/CDC42检测试剂 (PAK1 PBD, 琼脂糖) | Millipore | -- | |
| 流式细胞术 | gentleMACS组织处理器 | Miltenyi Biotec | -- |
| 肿瘤解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 红细胞裂解液 | Tiangen | -- | |
| 小鼠FcR阻断试剂 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 抗CD45抗体 | BD Biosciences | 564279 | |
| 抗CD3抗体 | BioLegend | 100219 | |
| 抗CD4抗体 | BioLegend | 100552 | |
| 抗CD8抗体 | BioLegend | 100752 | |
| 抗CD11c抗体 | BioLegend | 117307 | |
| 抗CD80抗体 | BioLegend | 104713 | |
| 抗CD86抗体 | BioLegend | 105031 | |
| 抗MHC-II抗体 | BioLegend | 107629 | |
| 抗CXCL9抗体 | BioLegend | 515606 | |
| BD FACSVerse流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| FlowJo软件 | BD Biosciences | -- | |
| 多重免疫荧光 | 3色TSA试剂盒 | WiSee Bio | D110071-50T |
| 抗CD11c抗体 (CST) | CST | 97585 | |
| 抗CD86抗体 (CST) | CST | 19589 | |
| 抗CD8抗体 (CST) | CST | 98941 | |
| 抗颗粒酶B抗体 | CST | 17215 | |
| 抗小鼠HRP二抗 | Yuanxibio | A10011-60 | |
| Aperio Versa 8组织成像设备 | Leica | -- | |
| 数据分析 | GraphPad Prism 9 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| NET-DNA与CCDC25结合实验 | 重组CCDC25蛋白的纯度和包被浓度、NET-DNA的制备和质量、药物处理浓度和时间。 阅读提示：Materials and methods: Recombinant CCDC25 production and purification, CCDC25-NET-DNA binding assay, Inhibitor screening of the FDA-approved drug library |
| 细胞实验 | 细胞系来源和培养条件、NETs的制备和浓度、药物处理浓度和时间、CCDC25敲除细胞系的构建。 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and animals, Purification of NET DNA, Cytoskeleton immunofluorescence staining, Cell membrane retention assay, Migration assays, Cell viability assay |
| 动物实验 | 小鼠品系、年龄、性别、饲养条件、肿瘤细胞接种方式（原位、脾内、皮下）、给药剂量、频率和途径、肿瘤体积测量方法、伦理审批。 阅读提示：Materials and methods: Animal experiments |
| 联合治疗实验 | PTX和di-Pal-MTO的给药剂量、频率和途径，DNase I的给药方案，肿瘤模型（原位、转移、术后复发），评估指标（肿瘤体积、转移灶、生存期）。 阅读提示：Materials and methods: Animal experiments, Results: Di-Pal-MTO combined with PTX inhibits the growth and metastasis of breast cancer, Di-Pal-MTO combined with PTX therapy suppresses postoperative metastasis |
| 免疫分析 | DC分化条件、DC与T细胞共培养比例、抗体克隆号、流式细胞术设门策略、免疫荧光染色条件。 阅读提示：Materials and methods: T-cell-mediated cytotoxicity assay, Flow cytometry, Multiplex immunofluorescence, Results: Di-Pal-MTO preserves the activation of DCs induced by NET-DNA |