疫苗设计与制备
构建表达XBB.1.5刺突蛋白的腺病毒载体和自组装三聚体RBD-HR蛋白，并混合制备双组分及三组分疫苗。
利用AdMax系统包装Ad5XBB.1.5，通过杆状病毒表达系统制备RBDXBB.1.5-HR和RBDBA.5-HR，并通过混合腺病毒和蛋白制备不同比例的疫苗。
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结合腺病毒和三聚体亚单位蛋白的鼻内疫苗对SARS-CoV-2奥密克戎变异株提供优越免疫
Intranasal vaccine combining adenovirus and trimeric subunit protein provides superior immunity against SARS-CoV-2 Omicron variant
实验完整度
高包括体外蛋白表达与结合验证、小鼠和仓鼠活病毒攻击及传播模型、多种基因敲除小鼠机制研究、scRNA-seq分析以及人体临床试验，涵盖多层级免疫原性、保护效果和机制验证。
主要模型
BALB/c小鼠 叙利亚金仓鼠 C57BL/6小鼠 70名人类参与者
重点核对
疫苗组分：Ad5XBB.1.5（5×10^9 VPs）与RBDXBB.1.5-HR（10 μg）混合 免疫程序：小鼠在第0、4、8周鼻内免疫3次 病毒攻击：1×10^6 PFU XBB.1.16活病毒（小鼠） 病毒传播模型：仓鼠接触/空气传播模型，供体感染1×10^4 PFU XBB.1.5 人体剂量：1×10^10或2×10^10 VPs Ad5XBB.1.5联合20或40 μg RBDXBB.1.5-HR，间隔14天两剂
摘要
黏膜免疫可有效保护上呼吸道感染，限制病毒脱落和传播。然而，目前尚无鼻喷雾COVID-19疫苗获得WHO批准全球使用。在此，我们开发了一种双组分鼻内疫苗，将表达XBB.1.5变异株刺突蛋白的腺病毒载体（Ad5XBB.1.5）与源自受体结合域（RBDXBB.1.5-HR）的自组装三聚体重组蛋白相结合。与单一组分相比，该双组分疫苗对XBB.1.5变异株诱导出优越的体液和细胞免疫。它还能在小鼠中提供针对活XBB.1.16病毒攻击的保护性免疫，并在仓鼠模型中阻止XBB.1.5病毒传播。值得注意的是，黏膜树突状细胞中STING信号通路的激活对于腺病毒载体的佐剂效应至关重要。我们还整合了来自BA.5变异株的另一种三聚体蛋白（RBDBA.5-HR），构建了三组分疫苗（Ad5XBB.1.5 + RBDXBB.1.5-HR + RBDBA.5-HR），其显示出增强的广谱中和能力。双组分疫苗在人体中表现出高度耐受性和安全性，诱导所有参与者增强的黏膜免疫和高水平中和抗体。我们的发现强调了这一策略用于临床COVID-19鼻内疫苗开发的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否通过结合腺病毒载体和亚单位蛋白的鼻内疫苗，诱导更强的黏膜和系统免疫应答，并提供对SARS-CoV-2奥密克戎变异株的保护？
- 核心机制
- 腺病毒载体通过激活黏膜树突状细胞中的STING信号通路，增强蛋白抗原的免疫原性，从而产生协同的体液和细胞免疫应答。
- 主要证据
- 在小鼠中，双组分疫苗诱导了更高的血清IgG、BALF IgA、中和抗体以及CD8+ TRM细胞；在Sting-/-小鼠中这些增强效应消失。仓鼠传播模型显示双组分疫苗可阻断病毒传播。人体试验显示黏膜IgA和血清中和抗体显著升高。
- 研究意义
- 该研究提供了一种基于腺病毒载体和亚单位蛋白组合的鼻内疫苗平台，可开发针对COVID-19及其他呼吸道疾病的安全有效的鼻内疫苗，具有临床转化潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
小鼠免疫原性评估
比较双组分疫苗与单组分疫苗诱导的体液和细胞免疫应答。
BALB/c小鼠鼻内免疫三次，检测血清和呼吸道分泌物中的结合抗体、中和抗体、TRM细胞、Tfh和GC B细胞。
STING通路机制研究
确定腺病毒载体佐剂效应所依赖的先天免疫信号通路。
使用多种基因敲除小鼠（Tlr2-/-, Tlr9-/-, Myd88-/-, Nlrp3-/-, Casp1-/-, Il1b-/-, Sting-/-, Cd8a-/-）免疫Ad5BA.5+RBDBA.5-HR或Ad5Empty+RBDBA.5-HR，检测抗体和TRM应答。
三组分疫苗广谱中和评估
测试添加BA.5三聚体蛋白的三组分疫苗是否能增强对多种奥密克戎亚变体的交叉中和。
制备三组分疫苗并免疫小鼠，检测血清中和抗体谱，并与双组分疫苗比较。
异源加强免疫评估
评估三组分疫苗作为mRNA疫苗后的异源加强是否增强免疫应答。
小鼠先肌注3剂mRNA疫苗，再用三组分疫苗鼻内免疫1或2剂，检测血清和黏膜免疫应答。
活病毒攻击保护实验（小鼠）
评估双组分疫苗对XBB.1.16活病毒攻击的保护效果。
小鼠免疫后，以1×10^6 PFU XBB.1.16病毒鼻内攻击，检测病毒载量和病理变化。
病毒传播保护实验（仓鼠）
评估双组分疫苗阻止病毒在宿主间传播的能力。
仓鼠免疫后，与感染XBB.1.5的供体仓鼠共笼，检测受体仓鼠的病毒载量和病理变化。
人体临床试验
评估双组分疫苗在人体中的安全性和免疫原性。
70名参与者接受两剂鼻内疫苗，检测不良事件和免疫应答。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白质表达与纯化 | pFastBac1载体 | -- | -- |
| Bac-to-Bac杆状病毒表达系统 | Invitrogen | -- | |
| Sf9昆虫细胞 | Thermo Fisher | 11496015 | |
| 蛋白质纯化 | Ni-TED HisTrap柱 | Nuptec Biosciences | NRPB58S |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL柱 | GE Healthcare | 28990944 | |
| 腺病毒构建 | HEK-293细胞 | ATCC | CRL-1573 |
| AdMax腺病毒系统 | Microbix | -- | |
| pDC316载体 | -- | -- | |
| pBHGloxΔE1,3Cre质粒 | -- | -- | |
| A549细胞 | ATCC | CCL-185 | |
| Western blot | 刺突蛋白抗体 | Sino Biological | 40591-MM42 |
| ELISA | 96孔板 | Corning | 42592 |
| TMB底物 | NeoBioscience | TMS.1000 | |
| 山羊抗小鼠IgG | Thermo Fisher | 31430 | |
| 山羊抗小鼠IgA | Abcam | ab97235 | |
| 山羊抗人IgG | Invitrogen | 62-8420 | |
| 山羊抗人IgA | Southern Biotech | 2050-05 | |
| 假病毒中和试验 | 假病毒 | Genomeditech | GM-0220PV07等 |
| 293T/ACE2细胞 | ATCC | CRL-11268 | |
| 荧光素酶底物 | Beyotime | RG005 | |
| 活病毒中和试验 | Vero细胞 | ATCC | CCL-81 |
| ELISpot | ELISpot板 | MABTECH | 3321-4AST |
| XBB.1.5刺突肽库 | GenScript | Customer designed | |
| 链霉亲和素-碱性磷酸酶 | -- | -- | |
| BCIP/NBT-plus底物 | -- | -- | |
| 流式细胞术 | 重组人ACE2蛋白 | ACROBiosystems | AC2-H52H4 |
| APC抗His标签抗体 | BioLegend | 362605 | |
| PerCP/Cyanine5.5抗小鼠CD3抗体 | BioLegend | 100218 | |
| Brilliant Violet 421抗小鼠CD4抗体 | BioLegend | 100438 | |
| Brilliant Violet 510抗小鼠CD8a抗体 | BioLegend | 100751 | |
| PE抗小鼠CD44抗体 | BioLegend | 103008 | |
| FITC抗小鼠CD69抗体 | BioLegend | 104506 | |
| APC抗小鼠CD103抗体 | BioLegend | 121414 | |
| PE/Cyanine7抗小鼠B220抗体 | BioLegend | 103222 | |
| FITC抗小鼠CD279 (PD-1)抗体 | BioLegend | 135214 | |
| APC抗小鼠CD185 (CXCR5)抗体 | BioLegend | 145506 | |
| 生物素标记的RBDXBB.1.5 | ACROBiosystems | SPD-C82Q3 | |
| Brilliant Violet 421抗小鼠CD19抗体 | BioLegend | 115549 | |
| PerCP/Cyanine5.5抗小鼠CD95抗体 | BioLegend | 152610 | |
| APC抗小鼠GL-7抗体 | BioLegend | 144618 | |
| PE偶联抗生物素抗体 | BioLegend | 409004 | |
| Precision Count计数微球 | BioLegend | 424902 | |
| 胶原酶I | Gibco | 17100-017 | |
| 胶原酶IV | Gibco | 17104-019 | |
| 脱氧核糖核酸酶I | KeyGen biotech | KGA1506-1 | |
| DMEM培养基 | Gibco | C11995500 | |
| 70微米尼龙网过滤器 | Falcon | 352350 | |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | C11875500 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099-141C | |
| 青霉素/链霉素 | Beyotime | ST488S | |
| β-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 白细胞介素-2 | Sigma-Aldrich | I0523 | |
| 布雷菲德菌素A | eBioscience | 00-4506-51 | |
| 固定/透化试剂盒 | BD | 554715 | |
| PE/Cyanine7抗小鼠IFNγ抗体 | BioLegend | 505826 | |
| Brilliant Violet 510抗小鼠TNF抗体 | BioLegend | 506339 | |
| 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | Novoprotein | CJ46 | |
| 白细胞介素-4 | Novoprotein | CK74 | |
| FluoReporter FITC蛋白标记试剂盒 | Invitrogen | F6434 | |
| PE/Cyanine7抗小鼠CD11c抗体 | BioLegend | 117318 | |
| NovoCyte流式细胞仪 | ACEA Biosciences | -- | |
| 单细胞测序 | 10x Genomics Chromium单细胞和VDJ文库构建系统 | 10x Genomics | -- |
| Illumina NovaSeq 6000测序系统 | Illumina | -- | |
| RT-qPCR | Bio-Rad CFX384 Touch实时荧光定量PCR检测系统 | Bio-Rad | -- |
| 病理学 | Pannoramic MIDI扫描仪 | 3DHISTECH | -- |
| NanoZoomer S360扫描仪 | HAMAMATSU PHOTONICS | -- | |
| 人体接种 | 一次性鼻腔雾化装置 | Xinfuda Medical | XFD-07-K-01 |
| 疫苗临床制备 | 威斯克生物 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 疫苗制备 | 腺病毒载体滴度、蛋白浓度、混合比例、缓冲液pH、储存温度和时间 阅读提示：Methods 'Vaccinations of mice' 和Extended Data Fig. 1b |
| 小鼠免疫 | 小鼠品系、周龄、剂量、免疫次数、间隔时间、样本采集时间 阅读提示：Methods 'Vaccinations of mice' 和Fig. 1c |
| 活病毒攻击 | 病毒株、滴度、攻击途径、时间点、组织收集时间 阅读提示：Methods 'Live SARS-CoV-2 virus challenge' 和Fig. 5a-d |
| 传播模型 | 仓鼠品系、免疫方案、供体感染剂量、共笼时间、检测时间 阅读提示：Methods 'Live SARS-CoV-2 virus challenge' 和Fig. 5g-j |
| 临床试验 | 参与者纳入标准、剂量、免疫间隔、样本采集时间、安全性评估 阅读提示：Methods 'Intranasal delivery of Ad5XBB.1.5 plus RBDXBB.1.5-HR vaccine in human participants' 和Fig. 6 |
| STING机制研究 | 基因敲除小鼠品系、免疫剂量、检测指标 阅读提示：Methods 'Vaccinations of mice' 和Fig. 3 |