检测HHEX在炎症结肠组织中的表达
探究HHEX是否在肠道炎症中表达失调。
对12例溃疡性结肠炎患者的炎症和相邻非炎症结肠组织进行Western blot分析，并通过IHC检测15例样本中HHEX的表达和定位。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
HHEX/IKKα正反馈环路促进肠道炎症
An HHEX/IKKα positive feedback loop promotes intestinal inflammation
实验完整度
高包含患者样本分析、细胞系功能实验、类器官实验、条件性基因敲除小鼠DSS结肠炎模型，并进行了机制验证（蛋白互作、磷酸化、泛素化）。
主要模型
HIEC-6细胞 HT29细胞 Villin-Hhexfl/fl小鼠（肠上皮特异性Hhex敲除） 肠道类器官
重点核对
HHEX蛋白在炎症结肠中的表达上调（Western blot和IHC） HHEX敲低或过表达对TNF-α诱导的炎症因子表达的影响 IKKα对HHEX S213的磷酸化及对HHEX/MID2相互作用的调节 HHEX与IKKα/IKKβ的相互作用及对IKK复合物组装的影响
摘要
NF-κB通路中IκB激酶（IKK）复合物的动态组装和调控是炎症性肠病（IBD）发病和进展的核心。我们最近报道转录因子造血表达同源盒（HHEX）促进结肠炎相关结直肠癌，但HHEX在肠道炎症中的潜在作用仍未明确。在此，我们发现在结肠炎小鼠模型和临床IBD样本中，HHEX在发炎结肠中表达上调。HHEX过表达增加炎症细胞因子的表达，而HHEX缺失在体外和体内分别基本消除炎症反应和肠道炎症。在机制上，IKKα在TNF-α刺激下磷酸化HHEX的S213位点，通过抑制HHEX与E3泛素连接酶MID2的相互作用以及随后的K48连接的泛素化和蛋白降解来稳定HHEX。重要的是，HHEX通过其N端结构域与IKKα/IKKβ复合物相互作用并稳定该复合物，从而激活NF-κB通路，并建立一个加剧肠道炎症的正反馈环路。我们的研究揭示了HHEX在促进IKK复合物组装和结肠炎中的非转录依赖性功能，将HHEX确定为IBD易感基因和IBD治疗的潜在靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- HHEX在肠道炎症中的生物学功能及其调控机制是什么？
- 核心机制
- IKKα磷酸化HHEX的S213位点，抑制HHEX与E3泛素连接酶MID2的相互作用，从而减少HHEX的K48连接的泛素化降解，稳定HHEX；HHEX通过其N端结构域与IKKα/IKKβ复合物相互作用并稳定该复合物，激活NF-κB通路，形成正反馈环路加剧肠道炎症。
- 主要证据
- 在患者样本中观察到HHEX表达上调并与病理评分相关；细胞和类器官实验证明HHEX促进TNF-α诱导的炎症反应；Villin-Hhexfl/fl小鼠DSS结肠炎模型证明HHEX敲除减轻炎症。
- 研究意义
- HHEX被确定为IBD易感基因和IBD治疗的潜在靶点，为靶向HHEX-IKK相互作用界面治疗IBD提供了理论依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证HHEX在肠上皮细胞炎症反应中的功能
确定HHEX是否调节TNF-α诱导的炎症反应。
在HIEC-6、HT29细胞中建立HHEX敲低或过表达，检测TNF-α刺激后炎症因子mRNA水平和NF-κB通路激活情况；在肠道类器官中过表达HHEX验证功能。
动物实验验证HHEX敲除对结肠炎的影响
评估HHEX在体内对DSS诱导结肠炎的作用。
使用Villin-Hhexfl/fl小鼠（肠上皮特异性Hhex敲除）和野生型对照，通过DSS诱导急性结肠炎，比较疾病严重程度、炎症因子表达和NF-κB通路激活情况。
分析HHEX与IKK复合物的相互作用
探究HHEX是否与IKKα/IKKβ相互作用并影响IKK复合物组装。
通过外源/内源/半内源共免疫沉淀（co-IP）检测HHEX与IKKα/IKKβ的相互作用，并评估HHEX过表达或敲低对IKKα/IKKβ结合的影响。
鉴定HHEX与IKK复合物相互作用的结构域
确定HHEX中与IKKα/IKKβ相互作用的关键结构域。
构建HHEX截短体，通过co-IP检测其与IKKα/IKKβ的结合，并评估N端结构域过表达对NF-κB通路和炎症因子表达的影响。
研究TNF-α对HHEX蛋白稳定性的调节
探究TNF-α是否稳定HHEX蛋白。
检测TNF-α处理后HHEX蛋白水平和半衰期变化，使用蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制剂CQ确定降解途径，并检测IKKα过表达对HHEX泛素化的影响。
鉴定HHEX的E3泛素连接酶MID2
确定介导HHEX泛素化降解的E3连接酶。
通过外源共转染筛选，鉴定MID2为HHEX的相互作用蛋白，验证MID2对HHEX表达、半衰期和K48连接泛素化的影响。
验证IKKα磷酸化HHEX S213的机制
探究IKKα磷酸化HHEX S213的生物学功能及其对HHEX/MID2相互作用的影响。
通过位点突变（S213A/S213E）、特异性抗体和共IP实验，验证IKKα对S213的磷酸化以及磷酸化对HHEX-MID2相互作用和HHEX稳定性的影响，并检测对炎症因子表达的影响。
探索HHEX对非经典NF-κB信号的调节
探究HHEX是否调节非经典NF-κB信号通路。
用LTα1β2刺激HT29细胞，检测HHEX对非经典NF-κB靶基因表达、p100加工及IKKα相互作用的影响，并分析Villin-Hhexfl/fl小鼠中M细胞标志物表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证机制链路
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 类器官培养 | 人结肠类器官试剂盒（无血清） | bioGenous | K2003-HC |
| 小鼠结肠类器官试剂盒（无血清） | bioGenous | K2204-MC | |
| 类器官培养基质 | YEASON | 40191ES08 | |
| Primocin | YEASON | 60281ES50 | |
| SB202190 | Selleck Chemicals | -- | |
| Y27632 | Selleck Chemicals | -- | |
| 药物处理 | 肿瘤坏死因子-α | R&D Systems | -- |
| 重组人淋巴毒素α1/β2蛋白 | R&D Systems | -- | |
| BAY11-7082 | Selleck Chemicals | -- | |
| MG132 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 氯喹 | MedChemExpress | -- | |
| 转染 | 脂质体转染试剂3000 | Invitrogen | -- |
| 聚乙烯亚胺 | -- | -- | |
| P3000试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Opti-MEM培养基 | Gibco | -- | |
| Western blot/免疫沉淀 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- |
| 抗FLAG磁珠 | Bimake | -- | |
| 抗HA磁珠 | Bimake | -- | |
| 抗GFP磁珠 | Bimake | -- | |
| Western blot | HHEX抗体 | R&D Systems | MAB83771 |
| IKKα抗体 | ABclonal | A2062 | |
| IKKβ抗体 | ABclonal | A19606 | |
| IKKγ抗体 | ABclonal | A0917 | |
| MID2抗体 | Invitrogen | PA5-117727 | |
| 磷酸化IKKα/β抗体 | Cell Signaling Technology | 2078S | |
| 磷酸化IκBα抗体 | Beyotime | AF1870 | |
| IκBα抗体 | Beyotime | AF1282 | |
| 磷酸化p65抗体 | Beyotime | AN371 | |
| p65抗体 | Beyotime | AF1234 | |
| NFκB2抗体 | Proteintech | 15503-1-AP | |
| TLE1抗体 | Proteintech | 66216-1-lg | |
| NOD2抗体 | ABclonal | A25228 | |
| 免疫荧光 | GP2抗体 | GeneTex | GTX134145 |
| Western blot | HA抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 |
| FLAG抗体 | Cell Signaling Technology | 14793 | |
| MYC抗体 | Cell Signaling Technology | 2276 | |
| GFP抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc9996 | |
| 泛磷酸化丝氨酸抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-81514 | |
| 磷酸化S213抗体 | Sanyou Bio | -- | |
| β-肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | A2228 | |
| Lamin B1抗体 | Proteintech | 12987-1-AP | |
| β-微管蛋白抗体 | ABclonal | A12289 | |
| 免疫沉淀 | 正常兔IgG | Cell Signaling Technology | 2729 |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | TaKaRa | -- |
| PrimeScript RT Master Mix试剂盒 | TaKaRa | -- | |
| SYBR Premix ExTaq | Yeasen | -- | |
| Applied Biosystems 7500快速实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 动物实验 | 葡聚糖硫酸钠 | -- | -- |
| 免疫荧光 | SABC Cy3偶联抗兔IgG抗体 | BOSTER | SA1074 |
| DAPI | -- | -- | |
| 显微镜 | 激光扫描共聚焦显微镜 | Olympus | -- |
| 质粒构建 | ClonExpress I一步克隆试剂盒 | Vazyme | -- |
| KOD诱变试剂盒 | Toyohiro | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者样本分析 | 患者样本的炎症/非炎症配对结肠组织来源、HHEX表达的检测方法（Western blot和IHC）、病理评分标准 阅读提示：人类组织样本和IHC方法部分，以及图1的图注 |
| 细胞实验 | 细胞系（HIEC-6、HT29）培养条件、TNF-α浓度（10 ng/mL）、处理时间、HHEX敲低/过表达效率 阅读提示：细胞系和试剂部分、建立稳定敲低和过表达细胞系的方法、图2图注 |
| 类器官实验 | 类器官培养体系（试剂盒、基质）、HHEX过表达方法、TNF-α浓度（10 ng/mL）、处理时间 阅读提示：类器官培养方法、图2图注 |
| 小鼠DSS结肠炎模型 | 小鼠品系（Villin-Hhexfl/fl和WT）、DSS浓度（3%）、处理时间（7天）、小鼠年龄和性别（8周龄雄性）、DSS给药方式 阅读提示：小鼠和DSS诱导结肠炎模型方法、图3图注 |
| 蛋白互作和翻译后修饰 | co-IP条件（细胞裂解液、抗体）、IKKα磷酸化HHEX S213的检测（p-S213抗体）、泛素化检测方法 阅读提示：Western blot分析、免疫沉淀和泛素化检测方法部分，以及图4-图7图注 |