单细胞分析揭示多囊卵巢综合征患者卵巢刺激后卵泡液排卵免疫功能的失调

Single-cell analysis of follicular fluid reveals dysregulation of ovulatory immune function in Polycystic Ovary Syndrome patients undergoing ovarian stimulation†

作者信息Andrea K Wegrzynowicz, Soma Banerjee, Emily Grimes, Riley Huddleston, Fernanda Leyva Jaimes, Laura G Cooney, Aleksandar K Stanic
PMID41766605
发布时间2026-05-13
DOI10.1093/biolre/ioag051

实验完整度

研究包含体外单细胞转录组与蛋白分析、患者样本(外周血和卵泡液)、供试者队列,并进行了功能验证和机制验证。

主要模型

卵泡液单核细胞(FFMCs) 外周血单核细胞(PBMCs) 巨噬细胞 单核细胞

重点核对

患者分组:PCOS和对照组各4例,按BMI分为非肥胖和肥胖亚组 样本处理:密度梯度离心分离PBMCs和FFMCs,ACK裂解去除红细胞 测序平台:10X Genomics平台,Illumina Novaseq X测序 差异表达分析:MAST、DESeq2,log2FC>0.25,FDR<0.05 细胞通讯分析:CellChat v2,CellChatDB.human数据库

摘要

多囊卵巢综合征(PCOS)是女性最常见的内分泌疾病,也是女性不孕的无排卵原因。虽然PCOS中全身循环的促炎细胞因子和白细胞偏向已有充分记录,但尚不清楚这种炎症如何延伸至卵巢或影响卵巢。此外,PCOS中排卵与炎症之间的关系也未明确定义。我们假设PCOS中的卵巢卵泡免疫环境存在独特的失调,且通过诱导排卵解决无排卵问题不足以缓解这种失调。通过对接受体外受精患者的外周血和卵泡液进行单细胞RNA和表面蛋白分析,我们发现对照组和PCOS卵泡在免疫学上均与循环不同。在系统层面,我们发现PCOS中的排卵诱导可能缓解全身性炎症。相反,虽然健康对照卵巢经历了急性免疫导向的排卵信号,但PCOS卵巢卵泡缺乏关键的促排卵细胞间通讯,反而表现出具有纤维化特征的慢性低度炎症状态。综上所述,出现了一幅图景:急性排卵展示了卵泡特异性免疫信息流的良好有序序列,而在PCOS卵泡中这些信息流被破坏并被低度慢性炎症所取代。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
PCOS患者的卵巢卵泡免疫环境是否与对照组和全身循环不同,以及诱导排卵是否能恢复正常的排卵免疫反应?
核心机制
PCOS卵泡缺乏如TNF、VEGF、IL1、IL10和CCL等促排卵信号通路,表现为慢性低度炎症和纤维化特征,而正常对照卵泡则有急性且平衡的免疫信号。
主要证据
通过CITE-seq分析8名患者(4名PCOS和4名对照)的外周血和卵泡液,发现PCOS卵泡中TNF和VEGF信号缺失,IL10抗炎信号不足,并伴有纤维化相关通路富集。
研究意义
该研究揭示了PCOS卵泡即使在排卵诱导后仍存在免疫失调,提示卵巢局部免疫调节可能成为改善PCOS生殖结局的潜在治疗靶点。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

样本收集与单核细胞分离

获取PCOS和对照患者的外周血和卵泡液样本,分离单核细胞用于后续分析。

从接受IVF的患者中,在TVOR时收集外周血和卵泡液,通过密度梯度离心分离PBMCs和FFMCs,并加入ACK裂解液去除红细胞。

2

活细胞富集与特征条形码标记

确保细胞活力,并对PBMCs和FFMCs进行标记以区分组织来源。

使用Dead Cell Removal Kit (Miltenyi) 富集活细胞。PBMCs和FFMCs分别用不同Hashtag抗体标记,然后合并上机。

3

单细胞转录组和蛋白组测序

获取单细胞水平的转录组和表面蛋白表达谱,以准确识别细胞类型。

采用CITE-seq技术,在10X Genomics平台进行文库制备和测序,获取转录组和蛋白表达数据。

4

数据预处理与细胞注释

质量控制、去除双细胞、聚类并注释细胞类型。

使用CellRanger处理序列数据,Seurat进行聚类。根据标记基因和抗体标签注释细胞类型,并进行亚聚类和细分注释。

5

差异表达与功能富集分析

鉴定卵泡液与外周血、PCOS与对照之间的差异表达基因及涉及的生物学通路。

使用MAST和DESeq2进行差异表达分析,通过clusterProfiler进行KEGG和GO富集分析。

6

细胞通讯分析

评估卵泡中细胞间配体-受体相互作用,比较PCOS和对照的信号通路。

使用CellChat v2和CellChatDB.human数据库,分析PCOS和对照组卵泡细胞间的信号通路和信息流。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

样本处理与细胞分离
数据处理与分析
差异表达与富集分析
细胞通讯分析
统计与组成分析

产品清单

实验环节名称品牌货号
死细胞去除试剂盒Miltenyi Biotec130-090-101
Octomacs磁分离柱Miltenyi130-042-109
Countess II细胞计数仪Invitrogen--
Fc受体阻断剂BioLegend422301
TotalSeqB0252抗人Hashtag 1抗体Biolegend394631
TotalSeqB0252抗人Hashtag 2抗体Biolegend394633

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
样本收集
患者分组、BMI匹配、IVF方案、触发药物
阅读提示:Table 1, Supplementary Tables S1 and S2, Methods: Subject recruitment
单核细胞分离
密度梯度离心方法、洗涤缓冲液、ACK裂解步骤
阅读提示:Methods: Sample preparation, Mononuclear cell isolation
活细胞富集
Dead Cell Removal Kit使用流程、起始细胞数量
阅读提示:Methods: Enrichment for live cells
特征条形码标记
Hashtag抗体浓度、孵育时间、温度
阅读提示:Methods: Multiplexing and feature barcode tagging of cells
单细胞测序
10X Genomics平台、测序仪型号、文库制备流程
阅读提示:Methods: Library preparations and sequencing
数据处理
CellRanger版本、参考基因组、质量控制阈值
阅读提示:Methods: CITEseq analysis, Single cell transcriptomics data Preprocessing