样本收集与单核细胞分离
获取PCOS和对照患者的外周血和卵泡液样本,分离单核细胞用于后续分析。
从接受IVF的患者中,在TVOR时收集外周血和卵泡液,通过密度梯度离心分离PBMCs和FFMCs,并加入ACK裂解液去除红细胞。
Single-cell analysis of follicular fluid reveals dysregulation of ovulatory immune function in Polycystic Ovary Syndrome patients undergoing ovarian stimulation†
研究包含体外单细胞转录组与蛋白分析、患者样本(外周血和卵泡液)、供试者队列,并进行了功能验证和机制验证。
卵泡液单核细胞(FFMCs) 外周血单核细胞(PBMCs) 巨噬细胞 单核细胞
患者分组:PCOS和对照组各4例,按BMI分为非肥胖和肥胖亚组 样本处理:密度梯度离心分离PBMCs和FFMCs,ACK裂解去除红细胞 测序平台:10X Genomics平台,Illumina Novaseq X测序 差异表达分析:MAST、DESeq2,log2FC>0.25,FDR<0.05 细胞通讯分析:CellChat v2,CellChatDB.human数据库
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
获取PCOS和对照患者的外周血和卵泡液样本,分离单核细胞用于后续分析。
从接受IVF的患者中,在TVOR时收集外周血和卵泡液,通过密度梯度离心分离PBMCs和FFMCs,并加入ACK裂解液去除红细胞。
确保细胞活力,并对PBMCs和FFMCs进行标记以区分组织来源。
使用Dead Cell Removal Kit (Miltenyi) 富集活细胞。PBMCs和FFMCs分别用不同Hashtag抗体标记,然后合并上机。
获取单细胞水平的转录组和表面蛋白表达谱,以准确识别细胞类型。
采用CITE-seq技术,在10X Genomics平台进行文库制备和测序,获取转录组和蛋白表达数据。
质量控制、去除双细胞、聚类并注释细胞类型。
使用CellRanger处理序列数据,Seurat进行聚类。根据标记基因和抗体标签注释细胞类型,并进行亚聚类和细分注释。
鉴定卵泡液与外周血、PCOS与对照之间的差异表达基因及涉及的生物学通路。
使用MAST和DESeq2进行差异表达分析,通过clusterProfiler进行KEGG和GO富集分析。
评估卵泡中细胞间配体-受体相互作用,比较PCOS和对照的信号通路。
使用CellChat v2和CellChatDB.human数据库,分析PCOS和对照组卵泡细胞间的信号通路和信息流。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 活细胞富集 | 死细胞去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-090-101 |
| Octomacs磁分离柱 | Miltenyi | 130-042-109 | |
| 细胞计数 | Countess II细胞计数仪 | Invitrogen | -- |
| 细胞标记 | Fc受体阻断剂 | BioLegend | 422301 |
| TotalSeqB0252抗人Hashtag 1抗体 | Biolegend | 394631 | |
| TotalSeqB0252抗人Hashtag 2抗体 | Biolegend | 394633 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集 | 患者分组、BMI匹配、IVF方案、触发药物 阅读提示:Table 1, Supplementary Tables S1 and S2, Methods: Subject recruitment |
| 单核细胞分离 | 密度梯度离心方法、洗涤缓冲液、ACK裂解步骤 阅读提示:Methods: Sample preparation, Mononuclear cell isolation |
| 活细胞富集 | Dead Cell Removal Kit使用流程、起始细胞数量 阅读提示:Methods: Enrichment for live cells |
| 特征条形码标记 | Hashtag抗体浓度、孵育时间、温度 阅读提示:Methods: Multiplexing and feature barcode tagging of cells |
| 单细胞测序 | 10X Genomics平台、测序仪型号、文库制备流程 阅读提示:Methods: Library preparations and sequencing |
| 数据处理 | CellRanger版本、参考基因组、质量控制阈值 阅读提示:Methods: CITEseq analysis, Single cell transcriptomics data Preprocessing |