hiPSC生成与验证
从PAIVS患者和健康对照中生成并验证多能干细胞系
从3名PAIVS患者和3名健康成人外周血中分离PBMCs，分选CD34+造血祖细胞，使用附加型载体转染，培养后通过免疫染色验证多能性标志物（OCT4、SOX2、SSEA4、TRA-1-81）。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
患者特异性诱导多能干细胞来源的心肌细胞工程化心脏组织的单细胞转录组学揭示右心发育不良综合征的异常发育轨迹和内在收缩缺陷
Single-Cell Transcriptomics of Engineered Cardiac Tissues From Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Reveals Abnormal Developmental Trajectory and Intrinsic Contractile Defects in Hypoplastic Right Heart Syndrome
实验完整度
高包含患者与健康对照的hiPSC-CMs分化、hCAS和hCTS工程化组织构建、scRNA-seq转录组分析、收缩力和电生理功能验证等多个独立证据层级。
主要模型
PAIVS患者来源的hiPSC-CMs 健康对照来源的hiPSC-CMs 人心脏各向异性片层（hCAS） 人心脏组织条（hCTS）
重点核对
PAIVS与健康对照各3例，共6个hiPSC系 hCTS在构建后7、11、14天，在1、1.5、2Hz电刺激下测量收缩力 hCAS在构建后第7天，在1Hz电刺激下进行光学映射 钙敏感性实验在hCTS构建后11天，1Hz刺激，钙浓度0.8-3.2mmol/L scRNA-seq数据经GEO accession GSE157157可获取
摘要
背景：为了理解肺动脉闭锁伴完整室间隔（PAIVS）中独立于解剖缺陷继发效应的内在心脏发育和功能异常，我们对患者和健康受试者来源的人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）及工程化组织模型进行了单细胞转录组和表型分析并进行了比较。方法和结果：我们从3名PAIVS患者和3名健康受试者中衍生出hiPSC系，并将其分化为hiPSC-CMs，随后将其生物工程化为分别用于电生理和收缩力评估的人心脏各向异性片层（hCAS）和人心脏组织条（hCTS）。对hiPSC-CMs、hCAS和hCTS进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq），以使用伪时间分析和差异表达分析检查任何表型异常的转录组基础。通过伪时间分析，我们证明生物工程组织构建体为hiPSC-CMs提供了促成熟信号，尽管在PAIVS hiPSC-CMs中成熟和发育减弱。此外，在PAIVS hCTS中观察到收缩力降低和收缩动力学延长。一致地，PAIVS hCTS和hiPSC-CMs的单细胞RNA测序显示心脏收缩装置基因表达降低。相比之下，PAIVS hCAS中未观察到电生理异常。结论：我们的发现首次揭示了PAIVS中独立于继发效应的心肌细胞发育和功能的内在异常。我们得出结论，hiPSC来源的工程化组织为研究原发性心脏异常和揭示散发性先天性心脏病背后的致病机制提供了一种独特的方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PAIVS中，独立于解剖缺陷和血流动力学异常的继发效应，心肌细胞是否存在内在的发育和功能异常？
- 核心机制
- PAIVS hiPSC-CMs中多个心脏收缩装置基因（如CSRP3、MYL2、MYH7、SORBS2、SYNPO2L、TPM1）和心脏成熟基因（如NPPB、FHL2、HOPX）表达下调，并伴随未成熟异构体（如MYH6）上调，导致收缩力降低和收缩动力学延长。
- 主要证据
- 通过scRNA-seq和RT-qPCR发现PAIVS hCTS和hiPSC-CMs中收缩装置和成熟基因表达降低；hCTS收缩力测量显示PAIVS组收缩力显著降低且动力学延长；hCAS电生理分析显示无显著异常；伪时间分析显示PAIVS hCAS发育轨迹延迟。
- 研究意义
- 本研究首次建立PAIVS患者特异性hiPSC-CMs模型，揭示内在心肌细胞异常可作为先天性心脏病功能障碍的原因，并为利用hiPSC和组织工程技术结合scRNA-seq模拟散发性先天性心脏病提供新方法。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
hiPSC-CM分化
将hiPSC分化为心肌细胞，评估分化效率
使用既定方案进行心脏分化，第14天通过流式细胞术评估cTnT阳性细胞比例。
hCTS构建及收缩力分析
构建三维心脏组织条并评估其收缩功能
将hiPSC-CMs与Matrigel、胶原I及人包皮成纤维细胞混合，在定制模具中聚合形成hCTS，使用高速相机和定制脚本测量收缩力和动力学。
hCAS构建及电生理分析
构建二维纳米图案化的心脏各向异性片层并评估其电生理特性
在纳米图案基底上培养hiPSC-CMs形成hCAS，使用荧光染料和光学映射系统测量动作电位和传导参数。
单细胞RNA测序及分析
揭示PAIVS与对照心肌细胞在转录组水平的差异
对hiPSC-CMs、hCAS和hCTS进行单细胞RNA测序，进行聚类、差异表达基因、GO富集和伪时间分析。
RT-qPCR验证
验证scRNA-seq中发现的差异表达基因
从hiPSC-CMs、hCAS、hCTS中提取RNA，进行逆转录和实时定量PCR，验证关键基因的表达变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| hiPSC生成 | SepMate | STEMCELL Technologies | -- |
| Lymphoprep | STEMCELL Technologies | -- | |
| 人CD34磁珠分选试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- | |
| StemSpan H3000 | STEMCELL Technologies | -- | |
| CC100 | STEMCELL Technologies | -- | |
| pCXLE-hOCT3/4-shp53 | -- | -- | |
| pCXLE-hSK | -- | -- | |
| pCXLE-hUL | -- | -- | |
| 人CD34细胞核转染试剂盒 | Lonza | -- | |
| Geltrex | Gibco | -- | |
| Essential 8培养基 | Gibco | -- | |
| hiPSC验证 | Triton X-100 | Sigma-Aldrich | -- |
| 抗OCT3/4抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-5279 | |
| 抗SOX2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-17320 | |
| 抗SSEA4抗体 | STEMCELL Technologies | MC-813-70 | |
| 抗TRA-1-81抗体 | Cell Signalling Technology | 4745S | |
| AF-488偶联驴抗山羊IgG | Invitrogen | A-11055 | |
| AF-488偶联山羊抗小鼠IgM | Invitrogen | A-21042 | |
| AF-488偶联驴抗小鼠IgG | Invitrogen | A-21202 | |
| DAPI | Invitrogen | -- | |
| ProLong Gold抗淬灭封片剂 | Invitrogen | -- | |
| LSM 700共聚焦显微镜 | Carl Zeiss AG | -- | |
| hiPSC-CM分化 | StemPro Accutase | Gibco | -- |
| 超低吸附6孔板 | Corning | -- | |
| Matrigel基质胶 | Corning | -- | |
| BMP4 | Gibco | -- | |
| Y-27632 | BioGems | -- | |
| StemPro-34无血清培养基 | Gibco | -- | |
| 抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| GlutaMAX-I | Gibco | -- | |
| Activin A | Gibco | -- | |
| IWR-1 | STEMCELL Technologies | -- | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | -- | |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences | -- | |
| 抗cTnT抗体 | Abcam | ab8295 | |
| FITC偶联大鼠抗小鼠IgG1 | BioLegend | 406605 | |
| FACSCanto II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| hCTS构建 | 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | -- |
| Falcon 70 μm过滤器 | BD Biosciences | -- | |
| 10 cm培养皿 | SPL Life Sciences | -- | |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | -- | |
| B27添加剂 | Gibco | -- | |
| 高糖DMEM | Gibco | -- | |
| 新生牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 两性霉素B | Gibco | -- | |
| I型胶原 | Gibco | -- | |
| 人包皮成纤维细胞 | -- | -- | |
| hCTS收缩力测量 | 无酚红高糖DMEM | Gibco | -- |
| Prosilica GX1050高速相机 | Allied Vision | -- | |
| LabVIEW VIs脚本 | National Instruments | -- | |
| MATLAB脚本 | MathWorks | -- | |
| hCTS钙敏感性实验 | 无钙无酚红DMEM | US Biological | -- |
| 氯化钙 | Sigma-Aldrich | -- | |
| hCAS构建 | 聚苯乙烯透明热缩膜 | -- | -- |
| UVO清洗机 | JeLight Company | -- | |
| Falcon 40 μm过滤器 | BD Biosciences | -- | |
| hCAS电生理分析 | di-8-ANEPPS | Molecular Probes | -- |
| DMEM-F12培养基 | Gibco | -- | |
| blebbistatin | Sigma-Aldrich | -- | |
| Tyrode's溶液 | -- | -- | |
| Master9刺激器 | AMPI | -- | |
| 单极点刺激电极 | Harvard Apparatus | -- | |
| MiCAM Ultima成像系统 | SciMedia | -- | |
| BV Ana成像软件 | SciMedia | -- | |
| hiPSC-CM免疫荧光 | 抗MYL2抗体 | Proteintech | 10906-1-AP |
| AF-488偶联F(ab')2山羊抗小鼠IgG | Invitrogen | A-11017 | |
| AF-555偶联山羊抗兔IgG | Invitrogen | A-21428 | |
| LSM 800共聚焦显微镜 | Carl Zeiss AG | -- | |
| scRNA-seq | TrypLE | Gibco | -- |
| IV型胶原酶 | Gibco | -- | |
| 死细胞去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- | |
| Chromium单细胞3' v2试剂盒 | 10X Genomics | -- | |
| HiSeq 2500测序系统 | Illumina | -- | |
| NovaSeq 6000测序系统 | Illumina | -- | |
| scRNA-seq分析 | Cell Ranger | 10X Genomics | -- |
| RT-qPCR | TRIzol LS试剂 | Invitrogen | -- |
| QuantiTect逆转录试剂盒 | Qiagen | -- | |
| StepOnePlus实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| KAPA SYBR FAST qPCR预混液试剂盒 | Kapa Biosystems | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| hiPSC生成 | PAIVS患者和健康对照各3例；外周血PBMC分离方法；CD34+细胞分选；转染方案；培养基和基质胶条件。 阅读提示：Methods: Generation of hiPSCs and hiPSC-CMs Specific to Patients With PAIVS |
| hiPSC-CM分化 | 分化方案：包括初始细胞密度、生长因子组合（BMP4、Activin A、IWR-1）及浓度、低氧条件、分化天数；cTnT阳性率。 阅读提示：Methods: Generation of hiPSCs and hiPSC-CMs Specific to Patients With PAIVS |
| hCTS构建及收缩力测量 | 细胞与基质比例；成纤维细胞浓度；测量时间点（7、11、14天）；刺激频率（1、1.5、2Hz）；钙敏感性实验条件。 阅读提示：Methods: hCTS Fabrication and Contractility Analysis; Figure 4 legend |
| hCAS构建及电生理分析 | 纳米图案尺寸；细胞接种密度；培养时间；光学映射参数（染料浓度、blebbistatin浓度、刺激参数）；测量参数。 阅读提示：Methods: hCAS Fabrication and Electrophysiological Analysis; Figure 6 legend |
| 单细胞RNA测序 | scRNA-seq文库制备试剂盒版本；测序平台；数据过滤标准；聚类参数；DEG和GO分析软件及阈值。 阅读提示：Methods: Single-Cell RNA Sequencing Library Preparation and Analysis |
| RT-qPCR | RNA提取方法；cDNA合成量；qPCR反应条件；内参基因；引物序列（补充表S2）。 阅读提示：Methods: Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Preparation and Analysis |