体外药效评估
评估IAL对AML细胞的细胞毒性作用及其与氧化应激的关系
使用THP-1细胞，通过CCK-8 assay检测IAL处理后细胞活力和IC50值；使用DCFH-DA探针检测IAL处理后ROS水平；使用NAC预处理验证ROS的介导作用。
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异土木香内酯通过靶向硒蛋白TXNRD1诱导AML焦亡并增强α-PD-1疗效
Isoalantolactone induces AML pyroptosis and potentiates α-PD-1 efficacy by targeting selenoprotein TXNRD1
实验完整度
高包含体外细胞实验、多种动物模型（PDX、同种移植瘤、CDX）以及临床样本分析，并通过CETSA、ITC、LC-MS/MS和位点突变进行了靶点验证和机制验证。
主要模型
THP-1人AML细胞系 C1498小鼠AML细胞系 患者来源的原代AML细胞 NOD/SCID小鼠PDX模型 C57BL/6小鼠同种移植瘤模型 C57BL/6小鼠CDX模型
重点核对
IAL对TXNRD1的抑制活性及不可逆结合 IAL与TXNRD1 Sec498残基的共价结合 TXNRD1敲低对THP-1细胞增殖的影响 IA联合抗PD-1治疗在C57BL/6小鼠中的疗效 IAL处理对AML细胞PD-L1表达的影响
摘要
AML的抑制性微环境限制了抗PD-1的疗效，使得诱导焦亡成为重塑该微环境的关键策略。本文鉴定出天然小分子异土木香内酯（IAL）可抑制胞质硫氧还蛋白还原酶1（TXNRD1）并触发AML细胞焦亡，从而增强抗PD-1抗体疗法的疗效。机制上，IAL的α,β-不饱和羰基通过Michael加成反应共价结合TXNRD1第498位硒代半胱氨酸残基（Sec498）。临床样本分析显示，TXNRD1在AML中过表达，并与不良预后相关。此外，我们发现有报道TXNRD抑制剂金诺芬（auranofin）对AML具有良好的疗效。抑制TXNRD1可激活转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ），进而上调caspase-3的转录，随后增加gasdermin E的切割，通过非经典途径诱导AML细胞焦亡。此外，增强的caspase-3活性促进poly ADP-ribose polymerase 1（PARP-1）的切割并上调PD-L1表达，从而增加对抗PD-1单克隆抗体的敏感性。总之，本研究强调了一种通过靶向TXNRD1诱导焦亡并改善免疫抑制微环境来增强AML抗PD-1单克隆抗体治疗的潜在方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 异土木香内酯（IAL）能否通过靶向TXNRD1诱导AML细胞焦亡，并增强抗PD-1疗法的疗效？
- 核心机制
- IAL通过Michael加成反应共价结合TXNRD1的Sec498残基，抑制其活性，进而激活PPARγ，上调caspase-3转录，增强GSDME切割，通过非经典途径诱导AML细胞焦亡；同时，caspase-3活性增强促进PARP-1切割并上调PD-L1表达，从而增强对抗PD-1抗体的敏感性。
- 主要证据
- 通过ITC、CETSA、LC-MS/MS和位点突变实验证实IAL直接靶向TXNRD1 Sec498；体外实验显示IAL诱导THP-1细胞焦亡并上调PD-L1；在PDX、同种移植瘤和CDX模型中，IAL抑制肿瘤生长、延长生存期，并增强抗PD-1疗效，伴随CD4+和CD8+ T细胞增加及MDSC减少。
- 研究意义
- 本研究揭示了通过靶向TXNRD1诱导焦亡以重塑免疫抑制微环境，从而增强AML抗PD-1单克隆抗体疗效的潜在策略，并确立了IAL作为TXNRD1抑制的先导分子模板。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
焦亡表型鉴定
验证IAL是否会诱导AML细胞发生焦亡，并初步探究其分子途径
通过光学显微镜和扫描电子显微镜观察细胞形态变化；通过Western blot检测cleaved-caspase-3和GSDME-NT的表达水平。
靶点鉴定与验证
确定IAL的直接分子靶点及其结合方式
通过ITC测定IAL与TXNRD1的结合亲和力；通过CETSA验证细胞内结合；通过DTNB还原实验测定酶活性；通过脱盐实验验证不可逆性；通过LC-MS/MS鉴定结合位点；通过点突变验证Sec498的关键作用。
作用机制解析
探究TXNRD1抑制后诱导焦亡的下游信号通路
通过RNA-seq分析AF处理后的转录组变化；通过Western blot检测PPARα、PPARβ、PPARγ的表达；通过免疫荧光检测PPARγ的核转位；使用GW9662抑制PPARγ验证其介导作用。
体内疗效评估
评估IAL在体内对AML的治疗效果及其对免疫微环境的影响
建立PDX、同种移植瘤和CDX小鼠模型，分别给予IAL、AF、DOX或联合抗PD-1抗体处理，监测肿瘤负荷、生存期、脾重，并通过流式细胞术和IHC分析免疫细胞变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 异土木香内酯 | Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd. | -- |
| 流式分析 | FITC标记的抗人CD45抗体 | Thermo Fisher Scientific | MHCD4501 |
| 酶活性检测 | TXNRD1活性检测试剂盒 | Solarbio Corp. | -- |
| ROS检测 | ROS检测试剂盒 (DCFH-DA) | Solarbio Corp. | 3130 |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | GIBCO | -- |
| 胎牛血清 | Life-iLab | -- | |
| 细胞分离 | 淋巴细胞-单核细胞分离液 | Jingmei | -- |
| 细胞转导 | Hyper传感器变体 | -- | -- |
| 药物处理 | 金诺芬 | -- | -- |
| 多柔比星 | -- | -- | |
| 抗体治疗 | 抗PD-1抗体 | -- | -- |
| RNA提取 | Trizol™试剂 | Yeasen | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | ThermoFisher | 89901 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | ThermoFisher | 23227 | |
| 增强化学发光检测系统 | YEASEN | 36222ES60 | |
| GAPDH抗体 | CST | D16H11 | |
| Caspase-3抗体 | Abclonal | A11319 | |
| cleaved-Caspase-3抗体 | abcam | ab198447 | |
| PPARα抗体 | Abclonal | A6697 | |
| PPARβ抗体 | Biorbyt | orb1089300 | |
| PPARγ抗体 | Abclonal | A0270 | |
| GSDME抗体 | Abcam | ab215191 | |
| PD-L1抗体 | Abclonal | A19135 | |
| 药物处理 | N-乙酰-L-半胱氨酸 | -- | -- |
| 酶活性检测 | DTNB | -- | -- |
| NADPH | -- | -- | |
| LC-MS分析 | 谷胱甘肽 | -- | -- |
| Hypersil GOLD™ C18色谱柱 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| UPLC-Q-Exactive Orbitrap质谱仪 | Thermo Fisher | -- | |
| LC-MS/MS分析 | NAP-5™脱盐柱 | Cytiva | -- |
| 二硫苏糖醇 | -- | -- | |
| 细胞热位移分析 | 蛋白酶抑制剂 | -- | -- |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | -- | -- |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| 免疫组化 | CD4抗体 | -- | -- |
| CD8抗体 | -- | -- | |
| Gr-1抗体 | -- | -- | |
| HRP标记的二抗 | -- | -- | |
| 共培养实验 | 植物血凝素-P | -- | -- |
| Jurkat-T细胞 | -- | -- | |
| 荧光成像 | Leica SP8共聚焦激光扫描显微镜 | Leica | -- |
| Leica DMi8 | Leica | -- | |
| 数据采集 | SpectraMax ABS酶标仪 | Molecular Devices | -- |
| ITC分析 | NANO ITC | -- | -- |
| 数据分析 | FlowJo | -- | -- |
| 统计分析 | Prism 8 | GraphPad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外细胞实验 | 细胞系：THP-1和C1498；培养条件：RPMI-1640培养基，10% FBS，100 U/mL青霉素-链霉素，37°C，5% CO2 阅读提示：看2.2节，细胞培养条件需严格按照描述进行。 |
| 靶点验证实验 | IAL与TXNRD1结合的Kd值：8.392 × 10^-8 mol/L 阅读提示：看3.3节，需要精准的ITC实验数据。 |
| 体外药效实验 | IAL对THP-1细胞的IC50值：17.56 ± 3.14 μmol/L 阅读提示：看3.1节，确保使用同样的处理时间(24小时)和检测方法(CCK-8)。 |
| 体内动物模型 | PDX模型：NOD/SCID小鼠，1×10^7原代AML细胞/只，尾静脉注射；同种移植瘤模型：C57BL/6小鼠，5×10^6 Luc-C1498细胞/只，尾静脉注射；CDX模型：C57BL/6小鼠，5×10^6 C1498细胞/只，皮下接种 阅读提示：看2.4节，需严格按照描述建立模型。 |
| 体内给药方案 | IAL剂量：30 mg/kg；AF剂量：5 mg/kg；DOX剂量：1.25 mg/kg；给药方式：腹腔注射，隔天一次，两周 阅读提示：看2.4节，确保给药剂量和方式一致。 |