建立急性耗竭系统
实现NIPBL和RAD21的急性降解，以研究cohesin动态的作用。
在hTERT RPE-1细胞中敲入FKBP12F36V标签，生成NIPBL和RAD21降解细胞系，并验证dTAGV-1处理后蛋白水平下降。
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急性NIPBL耗竭揭示环挤压的体内动态及其在转录激活中的作用
Acute NIPBL depletion reveals in vivo dynamics of loop extrusion and its role in transcription activation
实验完整度
高包含多个独立证据层级：细胞系模型（hTERT RPE-1、hiPSC及其分化细胞）、Hi-C、ChIP-seq、SLAM-seq等组学数据，以及STAG1/2敲除和dTAG急性耗竭功能验证。
主要模型
hTERT RPE-1细胞系 WTC11 hiPSC细胞系 hiPSC来源的心肌细胞 hiPSC来源的兴奋性神经元
重点核对
dTAGV-1浓度和NIPBL耗竭时间（1-24小时） Hi-C采样时间点（有丝分裂退出后30分钟间隔） STAG1或STAG2敲除细胞系 4sU标记时间（15或120分钟）进行SLAM-seq
摘要
基因组在三维空间中的组织高度动态，然而这些动态如何被调控以及它们在基因组功能中的作用尚不清楚。在这里，我们利用NIPBL的急性耗竭来表征cohesin介导的体内环挤压。我们发现，在NIBPL缺失后，许多染色质环迅速减少，但一些cohesin依赖性染色质环可持续数小时。这些持续存在的环在有丝分裂退出过程中需要NIPBL来建立，与不同的染色质状态相关，并且其持续性优先依赖于STAG1。此外，通过从多种细胞类型中耗竭NIPBL，我们发现NIPBL通过支持一种独特的局部基因组构象来专门调节细胞身份基因，这种构象的特点是邻近超级增强子的空间接近性更高，以及转录起始位点绝缘性更弱。总体而言，我们表明NIPBL介导的环挤压对体内基因组组织和转录调控至关重要。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- NIPBL介导的环挤压在体内如何动态调控基因组组织，其缺失如何影响转录激活。
- 核心机制
- NIPBL促进cohesin介导的环挤压，其急性耗竭导致许多环快速丧失，但存在依赖STAG1的持续性环；NIPBL通过增强TSS附近超级增强子接触并减弱TSS绝缘来激活谱系定义基因。
- 主要证据
- 在hTERT RPE-1、hiPSC来源的心肌细胞和神经元中，使用dTAG急性耗竭NIPBL，结合Hi-C、ChIP-seq、SLAM-seq等检测，显示NIPBL缺失时环结构迅速丧失或减弱，且敏感基因表现出独特的基因组组织模式。
- 研究意义
- NIPBL对基因组组织和转录调控至关重要，其介导的环挤压在细胞身份基因的激活中起关键作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估染色质组织改变
确定NIPBL耗竭对染色质环、TAD和区室的影响。
通过Hi-C和ChIP-seq检测NIPBL耗竭后的基因组组织变化，并分类环的NIPBL依赖性。
分析持续性环的特征
确定持续性环（混合依赖性簇）的分子特征及建立和维持机制。
使用STAG1/2敲除、ChIP-seq、ChromHMM分析等，研究持续性环对STAG1的依赖性及其与染色质状态的关联。
评估有丝分裂退出期间的转录激活
确定NIPBL在转录激活中的作用，特别是在有丝分裂退出时。
使用SLAM-seq监测有丝分裂退出过程中的新生转录，分析差异表达基因。
验证跨细胞类型的作用
确定NIPBL对谱系特异性基因的普遍调控作用。
在hiPSC来源的心肌细胞和神经元中耗竭NIPBL，进行SLAM-seq和Hi-C分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Thermo Fisher | 11330-057 |
| 胎牛血清 | Gibco | A5256701 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| DMEM培养基 | Corning | 10-013-CV | |
| Essential 8 Flex培养基 | Gibco | A2858501 | |
| mTeSR Plus培养基 | StemCell Technologies | 100-0276 | |
| 药物处理 | 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D2650 |
| dTAGV-1 | Tocris | 6914 | |
| 细胞周期同步 | 胸苷 | Sigma-Aldrich | T1895 |
| 诺考达唑 | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| 流式分析 | 碘化丙啶 | Abcam | ab14083 |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 488 鬼笔环肽 | Invitrogen | A12379 |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | |
| 蛋白印迹 | cOmplete无EDTA蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | COEDTAF-RO |
| 蛋白定量 | 蛋白测定试剂 | BioRad | 5000006 |
| 蛋白印迹 | 抗α-微管蛋白抗体 | Millipore | CP06100UG |
| 抗组蛋白H3抗体 | Cell Signaling | 4499 | |
| 抗HA抗体 | Cell Signaling | 3724 | |
| 抗MAU2/SCC4抗体 | Abcam | ab183033 | |
| 抗STAG1 N端抗体 | Invitrogen | PA5-57115 | |
| 抗STAG1 C端抗体 | Invitrogen | MA5-27807 | |
| 抗STAG2 N端抗体 | Cell Signaling | 5882 | |
| 抗STAG2 C端抗体 | Santa Cruz | sc-81852 | |
| 抗CTCF抗体 | Active Motif | 61932 | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling | 8884 | |
| 山羊抗小鼠IgG | Jackson | 115-035-071 | |
| 山羊抗兔IgG | Invitrogen | 31463 | |
| 免疫荧光 | 心肌肌钙蛋白T抗体 | Proteintech | 68300-1-Ig |
| 抗FOX3 (NeuN)抗体 | BioLegend | 834502 | |
| 抗Tubulin β3抗体 | BioLegend | 801207 | |
| ChIP-seq | Abflex抗CTCF抗体 | Active Motif | 91285 |
| 抗RAD21抗体 | Abcam | ab992 | |
| 抗STAG1抗体 | Invitrogen | PA5-57115 | |
| 抗STAG2抗体 | Cell Signaling | 5882 | |
| 抗SCC-112/PDS5A抗体 | Bethyl | A300-089A | |
| 抗WAPL抗体 | Proteintech | 16370-1-AP | |
| DSG交联剂 | Santa Cruz | sc-285455 | |
| Protein A磁珠 | Invitrogen | 10002D | |
| 蛋白酶K | NEB | P8107S | |
| RNA酶A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| Zymo ChIP DNA纯化浓缩试剂盒 | Zymo | D5205 | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | A63880 | |
| 2S Plus DNA文库构建试剂盒 | IDT | 10009878 | |
| Diagenode Microplex v3文库构建试剂盒 | Diagenode | C05010001 | |
| Unique Dual Indexes | Diagenode | C05010008 | |
| KAPA Illumina文库定量试剂盒 | Roche | KK4854 | |
| Hi-C | Arima Genomics Hi-C+试剂盒 | Arima Genomics | -- |
| Sera-Mag SpeedBead羧基修饰[E7]磁珠 | Cytiva | 45152105050250 | |
| Covaris M220超声破碎仪 | Covaris | -- | |
| KAPA HyperPrep文库构建试剂盒 | Roche | KK8502 | |
| Dynabeads MyOne链霉亲和素T1磁珠 | Invitrogen | 65601 | |
| TruSeq DNA单索引 | Illumina | 20015960 | |
| 独特组合双索引 | IDT | 10009909 | |
| RNA-seq | 4-硫代尿苷 | -- | -- |
| TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018 | |
| Direct-zol RNA小提试剂盒 | Zymo | R2052 | |
| SLAMseq动力学试剂盒-合成代谢动力学模块 | Lexogen | 061 | |
| RNA清洁与浓缩-5试剂盒 | Zymo | R1013 | |
| Zymo-Seq RiboFree总RNA文库试剂盒 | Zymo | R3003 | |
| 细胞分化 | STEMdiff心室心肌细胞分化试剂盒 | StemCell Technologies | 05010 |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| CHIR99021 | -- | -- | |
| SB431542 | -- | -- | |
| DMH-1 | -- | -- | |
| 双丁酰cAMP | -- | -- | |
| 层粘连蛋白 | -- | -- | |
| 脑源性神经营养因子 | -- | -- | |
| 胶质细胞源性神经营养因子 | -- | -- | |
| BrainPhys神经元培养基 | StemCell Technologies | 05790 | |
| 显微镜 | Olympus VS-120虚拟载玻片扫描显微镜 | Olympus | -- |
| Zeiss Axioscan 7载玻片扫描仪 | Zeiss | -- | |
| 流式分析 | BD LSR II流式细胞仪 | BD | -- |
| BD FACSymphony A3流式细胞仪 | BD | -- | |
| 流式分选 | BD Influx细胞分选仪 | BD | -- |
| 测序 | Illumina NextSeq 2000测序仪 | Illumina | -- |
| Illumina NovaSeqX测序仪 | Illumina | -- | |
| Illumina MiniSeq测序仪 | Illumina | -- | |
| Illumina NovaSeq6000测序仪 | Illumina | -- | |
| Element AVITI测序仪 | Element | -- | |
| 超声破碎 | Active Motif Epishear探头超声破碎仪 | Active Motif | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系、培养基、血清浓度、抗生素 阅读提示：Methods: Cell culture |
| NIPBL急性耗竭 | dTAGV-1浓度（500 nM）和处理时间 阅读提示：Methods: Cell culture |
| 细胞周期同步 | 双胸苷阻断和诺考达唑处理的时间、浓度 阅读提示：Methods: Cell cycle synchronization |
| Hi-C | 细胞数量、交联条件、限制酶消化、生物素标记、连接、DNA纯化、测序平台 阅读提示：Methods: In situ Hi-C |
| ChIP-seq | 抗体、固定时间、交联剂、超声条件、免疫沉淀量、测序平台 阅读提示：Methods: Chromatin immunoprecipitation for sequencing (ChIP-seq) |
| SLAM-seq | 4sU浓度（100 μM）和标记时间 阅读提示：Methods: SLAM-seq |
| 成像 | 细胞固定、透化、抗体浓度、染色时间 阅读提示：Methods: Cell imaging |