样本收集和多组学图谱构建
建立人类肺腺癌的细胞和空间图谱，以研究TP53突变对TME的影响。
从23例未治疗NSCLC患者收集肿瘤和匹配正常样本，进行WES、scRNA-seq、空间转录组（Visium）和mIF分析。
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肺腺癌中TP53相关组织重塑的细胞和空间图谱定义了多细胞肿瘤生态系统
A cellular and spatial atlas of TP53-associated tissue remodeling defines a multicellular tumor ecosystem in lung adenocarcinoma
实验完整度
高本研究结合scRNA-seq、空间转录组、WES、mIF等多个证据层级，并通过TCGA、CPTAC、外部scRNA-seq验证队列、小鼠模型和细胞系进行正交验证，包含明确的功能和机制验证。
主要模型
人肺腺癌肿瘤组织（23例未治疗患者） 基因工程小鼠模型（K和KP小鼠） A549 LUAD细胞系
重点核对
TP53突变状态（通过WES确定，分为TP53mut和TP53WT） scRNA-seq样本量（23例NSCLC，其中18例LUAD用于比较） 空间转录组（Visium）样本量和切片数（20张切片，14张用于分析） mIF验证的细胞类型和空间邻近性定义（如PD1+CD8+细胞与PDL1+细胞角蛋白+细胞接触/邻近） TCGA（n=510）和CPTAC（n=110）等外部验证队列的TP53突变分类
摘要
肿瘤蛋白p53（TP53）是许多癌症中最常发生突变的基因，并且与肺腺癌（LUAD）中较短的总生存期相关。在此，为了定义TP53突变如何影响LUAD肿瘤微环境（TME），我们构建了23个人类未治疗肺肿瘤的多组学细胞和空间图谱。我们发现，TP53突变的恶性细胞在可切除的临床样本、基因工程小鼠模型以及携带广泛TP53突变的细胞系中，一致地失去肺泡特性并上调高度增殖和熵增的基因表达程序。我们进一步确定了一个由SPP1+巨噬细胞和表达胶原的成纤维细胞组成的多细胞肿瘤微环境，该微环境与TP53突变肿瘤中的缺氧、促转移表达程序相一致。空间相关的血管生成抑制和免疫检查点相互作用，包括CD274–PDCD1和PVR–TIGIT，在TP53突变LUAD肿瘤中也富集，并可能产生对检查点阻断疗法更有利的反应。我们的系统性方法可用于研究其他癌症中基因型相关的TME。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TP53突变如何影响肺腺癌的肿瘤微环境，包括恶性细胞内在程序、基质细胞组成、免疫细胞状态和空间组织结构？
- 核心机制
- TP53突变导致恶性细胞失去肺泡特性并增加可塑性（熵增），通过SPP1+巨噬细胞和胶原成纤维细胞构成的空间微环境、SEMA3A–NRP1和TGFB2–TGFBR2等配体-受体相互作用，促进缺氧、EMT和免疫检查点信号。
- 主要证据
- 通过scRNA-seq、空间转录组和mIF分析，发现TP53mut肿瘤中恶性细胞表达细胞周期、缺氧、pEMT程序增加，AT2程序降低；内皮和周围细胞减少；SPP1+巨噬细胞和CAF.COLs成纤维细胞共定位；PDCD1–CD274和TIGIT–PVR相互作用富集。
- 研究意义
- 研究意义在于揭示TP53突变重塑TME的机制，为靶向TME的个性化治疗提供依据，并提示TP53mut LUAD可能对免疫检查点疗法更敏感。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
恶性细胞程序鉴定
识别与TP53突变相关的恶性细胞内在表达程序。
整合恶性细胞进行聚类，鉴定18个恶性程序子集，并与cNMF模块比较；比较TP53mut和TP53WT肿瘤中的程序表达。
肿瘤微环境组成比较
比较TP53mut和TP53WT肿瘤中非恶性细胞组成和表达差异。
分析内皮细胞、周细胞、髓系细胞、T/NK细胞和B细胞子集的组成和基因表达变化。
配体-受体相互作用分析
鉴定TP53mut肿瘤中富集的细胞间相互作用。
使用CellPhoneDB分析恶性细胞与内皮、髓系、T细胞等之间的配体-受体相互作用。
空间共定位和生态位鉴定
识别TP53mut肿瘤中空间共定位的细胞群，特别是成纤维细胞-巨噬细胞生态位。
使用ST数据计算细胞类型比例的相关性，并通过NMF识别空间因子（NMF7）。
体内和临床验证
验证TP53突变相关发现是否在临床样本和模型中存在。
在TCGA、CPTAC和外部scRNA-seq队列中验证恶性程序和TME改变；在小鼠模型和A549细胞系中验证。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
样本特征验证
空间转录组分析
蛋白表达验证
细胞间相互作用分析
转录因子调控网络分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织解离 | RPMI培养基 | -- | -- |
| 氯化铵-钾红细胞裂解缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
| 台盼蓝 | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 细胞分选 | CD45微珠 | Miltenyi Biotec | 130-045-801 |
| 组织解离 | Hanks平衡盐溶液 | Thermo Fisher Scientific | 14170112 |
| 蛋白酶 | Sigma Aldrich | 10165921001 | |
| 弹性蛋白酶 | Thermo Fisher Scientific | NC9301601 | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| 分散酶 | Sigma Aldrich | 4942078001 | |
| 胶原酶A | Sigma Aldrich | 10103578001 | |
| 胶原酶IV | Thermo Fisher Scientific | NC9836075 | |
| DNA提取 | AllPrep DNA/RNA提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| WES文库构建 | Kapa HyperPrep试剂盒 | Kapa Biosystems | -- |
| WES捕获 | Nextera外显子组试剂盒 | Illumina | -- |
| WES库自动化 | Agilent Bravo液体处理系统 | Agilent | -- |
| scRNA-seq文库构建 | Chromium控制器 | 10X Genomics | -- |
| Chromium单细胞3'文库和凝胶珠试剂盒 | 10X Genomics | PN-120237 | |
| 测序 | HiSeq X测序仪 | Illumina | -- |
| NextSeq测序仪 | Illumina | -- | |
| 空间转录组样本包埋 | OCT包埋剂 | TissueTek, Sakura | -- |
| 空间转录组 | Visium组织优化玻片 | 10X Genomics | 3000394 |
| Visium空间基因表达玻片 | 10X Genomics | 2000233 | |
| 空间转录组成像 | 蔡司Axio显微镜 | Zeiss | -- |
| Metafer玻片扫描平台 | Metasystems | -- | |
| VSlide软件 | Metasystems | -- | |
| 空间转录组测序 | NovaSeq测序仪 | Illumina | -- |
| 流式细胞术 | 流式细胞仪 | -- | -- |
| mIF | 抗CD8抗体 | Leica | CD8-4B11-L-CE |
| 抗PDL1抗体 | Cell Signaling | 13684 | |
| 抗PD1抗体 | Abcam | Ab137132 | |
| 抗细胞角蛋白抗体 | Dako | GA053 | |
| 抗α-SMA抗体 | Cell Signaling | 34105 | |
| 抗CD68抗体 | Cell Signaling | 76437 | |
| 抗OPN/SPP1抗体 | Abcam | ab214050 | |
| 抗CD31抗体 | Abcam | ab28364 | |
| mIF分析 | Inform 2.6软件 | Akoya Biosciences | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集和WES | 患者队列：23例NSCLC，治疗未经历；WES测序方法；TP53突变状态分类（TP53mut vs TP53WT） 阅读提示：Methods: Participants, WES sample processing, WES data processing |
| scRNA-seq | 细胞数（166,821），整合方法（Seurat CCA），恶性细胞鉴定（inferCNV），CD45+细胞去除 阅读提示：Methods: Tissue processing, CD45 sorting and scRNA-seq, scRNA-seq library preparation and sequencing, scRNA-seq preprocessing, scRNA-seq integration, clustering, annotation and doublet removal |
| 空间转录组 | 切片数（20张，14张用于LUAD分析），Visium处理条件（透化时间12分钟），Tangram参数 阅读提示：Methods: Tissue processing for ST, Visium spatial gene expression library generation, ST data processing and analysis |
| mIF | 抗体克隆和稀释度，ROI选择，空间邻近性定义（直接接触、邻近、50μm内） 阅读提示：Methods: mIF and analysis; Figure legends 7a-c |
| 数据分析 | TCGA和CPTAC数据版本（TCGA n=510, CPTAC n=110），TP53突变分类（DNE, LOF, impactful），统计检验（Mann-Whitney, Cox回归） 阅读提示：Methods: Effects of comutations and TP53 variant classes, Survival analysis, Statistics and reproducibility |