异种造血细胞的生成
通过两种策略在啮齿动物中生成异种造血细胞，并比较嵌合效率。
采用骨髓移植（BMT）和囊胚互补（BC）两种方法：BMT将小鼠Lin− HSPCs移植到免疫缺陷SRG大鼠，或大鼠Lin− HSPCs移植到NSG小鼠；BC将DA大鼠tdTomato标记的ES细胞注入NSG小鼠囊胚。
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功能性异种造血细胞维持供体主导身份和免疫耐受以用于治疗
Functional xenogeneic hematopoietic cells maintaining donor-dominant identity and immune tolerance enable therapy
实验完整度
高涉及体外模型（细胞系、原代细胞）、动物模型（小鼠、大鼠）和患者样本，包含功能验证（输血、CAR-T治疗）和机制验证（转录组、蛋白质组分析）。
主要模型
SD大鼠 NSG小鼠 B6小鼠 SRG大鼠 DA大鼠胚胎干细胞 SEM白血病小鼠模型
重点核对
骨髓移植模型：供体Lin− HSPCs移植到免疫缺陷大鼠/小鼠，八周后检测外周血嵌合率（如SD-to-NSG：WBC 99.9%，RBC 95.6%，PLT 99.9%）； 囊胚互补模型：DA大鼠ES细胞注入NSG小鼠囊胚，外周血tdTomato+有核细胞仅3.84%，RBC 0.036%，无PLT检测到； 异种细胞免疫排斥检测：单次输注后监测28天，检测IgG/IgM抗体水平，RBCs from B6-to-SRG在第7天IgG轻度升高； 出血性贫血模型：B6小鼠400μL血丢失后输注4×10^9 RBCs，每日CBC监测7天；地中海贫血模型：转基因小鼠输注后监测MCH、MCHC和NRBC超过10天； 血小板减少症模型：B6小鼠5 Gy照射诱导，输注5×10^8 PLTs后1天检测PLT计数和出血时间； CAR-T治疗：NSG小鼠经白消安处理，接种1.5×10^6 SEM-GFP-Luc细胞，第2、8、16天输注1×10^6 CAR-T细胞，监测生物发光至第23天。
摘要
背景：造血细胞的临床供应受到供体捐献限制和体外生成效率低下的严重制约。虽然在物种间嵌合体中生成这些细胞提供了一种突破性的替代方案，但由此产生的异种造血细胞的基本生物学特性和治疗潜力仍知之甚少。方法：我们通过囊胚互补和骨髓移植在啮齿动物模型中生成了异种造血细胞。使用单细胞RNA测序和蛋白质组学对这些细胞进行了全面的比较分析。通过反向移植到一系列供体物种疾病模型（包括出血性贫血、地中海贫血、血小板减少症和白血病）中，严格评估了其功能效力。结果：骨髓移植产生的嵌合效率显著高于囊胚互补。异种造血细胞，包括红细胞、血小板和白细胞，表现出以供体特异性为主的转录和蛋白质组特征。关键的是，这些细胞在反向输注时未引发显著的免疫排斥。功能上，异种红细胞拯救了出血性贫血和地中海贫血模型，血小板减轻了血小板减少症，而经嵌合抗原受体工程改造的异种T细胞有效抑制了白血病进展。此外，异种造血细胞的植入部分重建了免疫缺陷受体的脾脏形态和功能。结论：我们的研究首次对物种间生物反应器中生成的异种造血细胞进行了全面的功能验证。我们明确证明这些细胞具有类似供体的分子身份，逃避免疫排斥，并作为有效的“种子细胞”拯救多种血液疾病。这项工作为利用物种间嵌合体克服输血和细胞治疗的严重短缺建立了一种变革性范式。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 异种造血细胞是否具有供体样分子特征、是否引起免疫排斥以及能否作为治疗种子细胞？
- 核心机制
- 异种造血细胞在转录和蛋白质水平上保持供体主导身份，尽管含有异种蛋白但未引发显著免疫排斥，从而可被反向移植用于治疗。
- 主要证据
- 骨髓移植产生的嵌合效率高于囊胚互补；单细胞RNA测序和蛋白质组学显示异种细胞与供体更相似；输注异种RBCs、PLTs及CAR-T细胞分别改善出血性贫血、地中海贫血、血小板减少症和白血病模型；脾脏移植部分恢复脾功能。
- 研究意义
- 本研究首次全面验证了异种造血细胞的功能和治疗潜力，为利用物种间嵌合体解决输血和细胞疗法短缺提供了范式。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
异种造血细胞的分子特征分析
评估异种造血细胞是否保持供体样转录和蛋白质组特征。
通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）和蛋白质组学（DIA）分析外周血、骨髓、脾脏中的造血细胞，比较供体、受体和嵌合体。
免疫排斥评估
检验异种造血细胞是否引起免疫排斥。
检测嵌合细胞中的异种蛋白，并分析输注后供体动物中IgG/IgM抗体水平。
体外功能验证
评估异种血小板的体外功能。
进行血小板铺展实验，测量静息和活化状态下的细胞面积。
体内疾病模型治疗
评估异种红细胞、血小板和CAR-T细胞的体内治疗效果。
分别建立出血性贫血、地中海贫血、血小板减少症和白血病小鼠模型，输注相应异种细胞或CAR-T细胞。
脾脏移植评估
评估含异种造血细胞的脾脏移植后的功能恢复。
对SD大鼠进行脾切除，然后移植来自B6或SD-to-NSG嵌合体的脾脏，监测血流、组织结构、补体沉积和tuftsin水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证免疫效应
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 流式细胞术 | FITC抗大鼠RT1A抗体 | BD Pharmingen | 559,996 |
| APC/Cyanine7抗小鼠CD45抗体 | BioLegend | 103,116 | |
| PE抗大鼠Ter-119抗体 | Miltenyi Biotec | 130-109-560 | |
| BV785抗小鼠Ter-119抗体 | BioLegend | 116,245 | |
| BV421抗大鼠CD42d抗体 | BD OptiBuild | 743,617 | |
| PE抗小鼠CD41抗体 | BioLegend | 133,905 | |
| V450抗大鼠CD11b抗体 | BD Horizon | 562,108 | |
| PE/Cyanine7抗大鼠CD45RA抗体 | BioLegend | 202,316 | |
| PE抗大鼠CD3抗体 | BioLegend | 201,412 | |
| APC抗大鼠CD161抗体 | BioLegend | 205,606 | |
| PerCP/Cyanine5.5抗小鼠CD11b抗体 | BioLegend | 101,227 | |
| PE抗小鼠NK-1.1抗体 | BioLegend | 156,503 | |
| BV510抗小鼠B220抗体 | BioLegend | 103,247 | |
| BV421抗小鼠CD3抗体 | BioLegend | 100,227 | |
| 细胞分离 | 生物素抗小鼠谱系抗体混合物 | BioLegend | 133,307 |
| 生物素抗大鼠CD45RA抗体 | BioLegend | 202,303 | |
| 抗体检测 | PE抗小鼠IgM抗体 | BioLegend | 406,508 |
| PE抗大鼠IgM抗体 | BioLegend | 408,918 | |
| FITC抗小鼠IgG抗体 | BioLegend | 406,001 | |
| FITC抗大鼠IgG抗体 | BioLegend | 405,404 | |
| 免疫组化 | 抗C3抗体 | Abcam | EPR19394 |
| 补体C5a多克隆抗体 | Thermo-Fisher | PA5-78891 | |
| 细胞分离 | Histopaque-1119 分离液 | Sigma | 111910199ML |
| 红细胞裂解 | 1× 红细胞裂解液 | ThermoFisher | 00-4333-57 |
| 磁珠分选 | AutoMACS 运行缓冲液 | Miltenyi | 130-091-221 |
| MojoSort™ 链霉亲和素纳米磁珠 | BioLegend | 480,016 | |
| 抗PE超纯微珠 | Miltenyi | 130-105-639 | |
| 细胞培养 | 杜氏磷酸盐缓冲液 | BasalMedia | B210KJ |
| RPMI 1640 培养基 | BioAgrio | LR1634 | |
| 动物麻醉 | 异氟烷 | RWD | R510-22-10 |
| 胚胎培养 | KSOM 培养基 | Millipore | MR-106-D |
| 动物麻醉 | 三溴乙醇 | aladdin | T161626-100 |
| 活体成像 | D-荧光素钠盐 | Yeasen | 40901ES03 |
| T细胞分选 | EasySep 小鼠 CD90.2 阳性分选试剂盒 II | Stemcell | 18,951 |
| T细胞培养 | ImmunoCult-XF T 细胞扩增培养基 | Stemcell | 10,981 |
| 小鼠 IL-2 | PeproTech | 212-12-50UG | |
| T细胞激活 | ImmunoCult 小鼠 T 细胞激活试剂盒 | Stemcell | 100–1572 |
| 药物处理 | 白消安 | Sigma-Aldrich | B2635-10G |
| 药物溶解 | 聚乙二醇300 | TargetMol | T7022-100 |
| 吐温80 | TargetMol | T13947-50 | |
| 细胞培养 | 胎牛血清（新西兰源） | HyClone | SH30406.05 |
| 青霉素-链霉素 | BioAgrio | XA4122 | |
| 磷酸盐缓冲液（10×） | Beyotime | ST476 | |
| 碳酸氢钠 | Sangon Biotech | A500873-0500 | |
| 血小板分离 | 马铃薯来源的腺苷三磷酸双磷酸酶 | Sigma | A6132-500UN |
| EDTA 溶液 pH 8.0（0.5 M） | PanReac AppliChem | A4892.0500 | |
| 血液采集 | 枸橼酸钠 3.8% | Yuanye | 24184-100 |
| 透化 | Triton X-100 | Beyotime | ST795 |
| 染色 | TRITC 标记的鬼笔环肽 | Yeasen | 40734ES75 |
| 封片 | 抗淬灭封片剂 | Beyotime | P0126-25 |
| ELISA | 大鼠 Tuftsin ELISA 试剂盒 | COIBO BIO | CB12604-Ra |
| 大鼠 IgM ELISA 试剂盒 | YOBIBIO | U48-2775E | |
| 大鼠补体C3 ELISA 试剂盒 | YOBIBIO | U48-1300E | |
| 大鼠补体C4 ELISA 试剂盒 | YOBIBIO | U48-1301E | |
| 大鼠补体C5a ELISA 试剂盒 | YOBIBIO | U48-2152E | |
| 流式细胞术 | BD LSRFortessa X-20 流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 单细胞测序 | Chromium Next GEM 芯片 G | 10x Genomics | -- |
| Illumina NovaSeq 6000 测序仪 | Illumina | -- | |
| 质谱分析 | Orbitrap Exploris 480 质谱仪 | Thermo Fisher | -- |
| EASY-nano-LC 1200 液相色谱 | Thermo Fisher | -- | |
| 显微镜 | 尼康共聚焦激光扫描显微镜 | Nikon | -- |
| 激光散斑血流成像 | MoorLDI2-HIR 激光散斑血流成像仪 | Moor Instruments | -- |
| 光学显微镜 | 徕卡 DM2500 LED 显微镜 | Leica Microsystems | -- |
| 数据采集与分析 | GraphPad Prism 9 软件 | GraphPad Software | -- |
| FlowJo 10.8.1 软件 | FlowJo | -- | |
| Living Image 4.4 软件 | Revvity | -- | |
| ImageJ 软件 | NIH | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 骨髓移植 | 供体细胞来源、数量、受体照射剂量、移植时间（如小鼠Lin−细胞6×10^7细胞，受体6 Gy照射；大鼠Lin−细胞2×10^7细胞，受体1.8 Gy照射） 阅读提示：Materials and methods: Bone marrow transplantation |
| 囊胚互补 | ES细胞品系、注入数量、受体小鼠品系、移植胚胎数（如DA大鼠ES细胞10-15个，NSG囊胚，14-16个移植到ICR） 阅读提示：Materials and methods: Blastocyst complementation |
| 免疫排斥检测 | 输注细胞类型和数量、时间点（单次输注后监测28天）、检测抗体种类（IgG, IgM） 阅读提示：Materials and methods: Measurement of anti-RBCs/WBCs/PLTs IgG and IgM levels |
| RBC治疗实验 | 模型诱导方法（失血400μL、转基因小鼠）、输注细胞数量（4×10^9）、监测频率和时间（每日CBC 7天；地中海贫血监测MCH、MCHC、NRBC） 阅读提示：Materials and methods: Animal assays for RBC treatment |
| PLT治疗实验 | 血小板减少症诱导（5 Gy照射）、输注细胞数量（5×10^8）、检测时间（1天后CBC和出血时间） 阅读提示：Materials and methods: Animal assays for PLT treatment |
| CAR-T治疗实验 | CAR-T细胞来源（B6-to-SRG脾脏）、细胞类型（CD19/CD133 CAR）、白血病模型（SEM-GFP-Luc）、细胞数量（1.5×10^6 SEM细胞、1×10^6 CAR-T细胞）、输注时间（第2、8、16天） 阅读提示：Materials and methods: CAR-T assays |
| 脾脏移植 | 受体（3周龄SD大鼠）、移植类型（脾切除后异位移植）、监测时间点（术后1、3天血流和组织；术后1天补体；术后7、14天tuftsin）； 阅读提示：Materials and methods: Animal assays for xenogeneic spleen transplantation |