建立MyD88敲入巨噬细胞模型
在内源水平标记MyD88，以便研究其行为和相互作用。
使用CRISPaint技术在人THP-1和小鼠iBMDM中敲入AGF标签（APEX2-mEGFP-3×Flag），并通过RT-qPCR、免疫印迹、流式细胞术和ELISA验证标签不影响MyD88功能。
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内源性Toll样受体信号通路的分子定义
Molecular definition of the endogenous Toll-like receptor signalling pathways
实验完整度
高包含基因敲入细胞构建、活细胞成像、蛋白质组学、超分辨显微镜、CRISPR敲除功能验证、感染模型等多个独立证据层级，并具有明确的功能和机制验证。
主要模型
人THP-1巨噬细胞系 小鼠永生化骨髓来源巨噬细胞（iBMDM） 单核细胞增生李斯特菌感染的iBMDM模型
重点核对
MyD88-AGF敲入细胞中AGF标签不影响MyD88功能 LPS刺激浓度100 ng/ml，Pam3CSK4浓度和TLR激动剂 IRAK4激酶抑制剂zimlovisertib浓度为20 μM L. monocytogenes感染复数MOI=10（活细胞成像为30） MyD88表达水平与myddosome组装及信号传导的相关性
摘要
先天免疫模式识别受体，如Toll样受体（TLRs），是免疫应答感染的关键介质，也是我们理解健康和疾病的核心。微生物检测后，这些受体激活炎症信号转导通路，涉及IκB激酶、丝裂原活化蛋白激酶、泛素连接酶和其他衔接蛋白。连接TLR通路中蛋白质的机制尚不清楚。为了描绘TLR通路活性，我们改造了巨噬细胞，使内源性myddosome组分MyD88能够进行显微镜和蛋白质组学分析。我们发现myddosome与激活的TLR形成瞬时接触，并且无TLR的myddosome在24小时过程中其大小、数量和组成是动态变化的。超分辨显微镜分析显示，在大多数myddosome内，MyD88形成桶状结构，作为效应蛋白募集的支架。蛋白质组学分析表明，myddosome包含在TLR通路所有阶段起作用并调节所有效应反应的蛋白质，遗传分析定义了这些效应模块之间的上位关系。在单核细胞增生李斯特菌感染的细胞中，myddosome组装明显，但这些细菌在细胞间传播过程中逃避了myddosome组装和TLR信号传导。基于这些发现，我们提出整个TLR信号通路在myddosome内执行。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 内源性TLR信号通路如何在细胞中组织并执行？myddosome在其中的作用是什么？
- 核心机制
- 整个TLR信号通路在myddosome内执行，MyD88形成桶状支架，招募并激活下游效应蛋白，包括IKK、MAPK、TBK1等，且该过程受IRAK4动态调控。
- 主要证据
- 通过荧光显微镜观察myddosome动态，蛋白质组学鉴定myddosome组分，遗传敲除验证功能，以及感染模型证明细菌可逃避myddosome组装。
- 研究意义
- 重新定义了TLR信号通路的执行场所，为理解炎症和宿主防御提供了新视角。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
观察myddosome动态和结构
描述myddosome的形成、寿命、移动和亚细胞结构。
使用TIRF-M、共聚焦显微镜、FRAP和STED超分辨显微镜观察细胞在PAMP刺激后的myddosome动态、组分和纳米级结构。
鉴定myddosome组成成分
鉴定myddosome相关的蛋白质和信号模块。
利用APEX2介导的邻近标记结合质谱，在刺激后0.5、1、3、12小时鉴定myddosome相关蛋白，并通过STRING分析和k-means聚类分类模块。
验证myddosome的信号功能
验证myddosome是信号激活的场所。
通过免疫共沉淀、免疫印迹和免疫荧光检测myddosome中激活的激酶和转录因子，并评估下游信号转导。
遗传分析myddosome调控机制
确定IRAK激酶和其他信号蛋白在myddosome动态和功能中的作用。
生成IRAK1、IRAK2、IRAK4、TRAF6、TBK1、IKKα/β/γ、p65、p38α等敲除细胞，观察myddosome形成、动态、组成和信号输出。
研究自噬在myddosome清除中的作用
探究自噬是否参与myddosome的清除。
生成ATG5、ATG12、p62敲除细胞，检测myddosome清除和信号通路变化。
评估李斯特菌感染对myddosome的影响
研究细菌感染对myddosome组装和信号的影响。
用L. monocytogenes感染iBMDM，观察myddosome形成、信号激活和细胞间传播对myddosome的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11875093 |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | R&D systems | -- | |
| 细胞分化 | 佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯 | Sigma-Aldrich | P1585 |
| 基因诱导 | 多西环素 | Sigma-Aldrich | D9891 |
| TLR刺激 | 脂多糖（LPS）O55:B5 | Enzo | ALX-581-013 |
| Pam3CSK4 | Invivogen | vac-pms | |
| 脂磷壁酸 | Invivogen | tlrl-pslta | |
| Pam2CSK4 | Invivogen | tlrl-pm2s | |
| 聚肌胞苷酸 | Invivogen | tlrl-pic | |
| 鞭毛蛋白 | Invivogen | tlrl-epstfla | |
| R848 | Invivogen | vac-r848 | |
| CpG DNA (ODN1826) | Invivogen | tlrl-1826 | |
| IRAK4抑制 | 齐姆洛韦替尼/PF-06650833 | MedChemExpress | HY-19836 |
| 细菌培养 | 脑心浸液琼脂 | Becton Dickinson | 237500 |
| 氯霉素 | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| 细菌转染 | pLOV质粒 | -- | -- |
| 抗生素处理 | 庆大霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15750060 |
| 基因编辑 | CRISPaint系统 | Addgene | -- |
| 微环DNA生产试剂盒 | System Biosciences | MN900A-1 | |
| 嘌呤霉素 | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| 慢病毒转导 | Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 |
| 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | TR1003 | |
| 细胞分选 | LIVE/DEAD可固定紫死活细胞染料 | Thermo Fisher Scientific | L34964 |
| 蛋白样品制备 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Millipore | 539134 | |
| 原钒酸钠 | Sigma-Aldrich | 567540 | |
| β-甘油磷酸 | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| 蛋白定量 | Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 |
| 凝胶电泳 | NativePAGE上样缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | BN2003 |
| NativePAGE 4-16% Bis-Tris凝胶 | Thermo Fisher Scientific | BN2112BX10 | |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| 免疫印迹 | SuperSignal West Pico PLUS化学发光底物 | Thermo Fisher Scientific | 34580 |
| Restore PLUS Western Blot剥离缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | 46430 | |
| 免疫沉淀 | 蛋白G琼脂糖珠 | Millipore | P3296 |
| 抗Flag(M2)琼脂糖珠 | Millipore | A2220 | |
| 3×Flag肽 | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596026 |
| GlycoBlue | Thermo Fisher Scientific | AM9516 | |
| RT-qPCR | 高通量cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 4368813 |
| iTaq通用SYBR Green超混液 | Bio-Rad | 1725121 | |
| CFX384实时荧光定量PCR系统 | Bio-Rad | -- | |
| 细胞因子检测 | IL-6和TNF ELISA试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 88-7066-88, |
| 细胞毒性检测 | CyQUANT LDH细胞毒性检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | C20301 |
| ROS检测 | H2DCFDA | Thermo Fisher Scientific | D399 |
| 蛋白质组学 | 生物素酚 | Sigma-Aldrich | SML2135 |
| Pierce链霉亲和素磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 88817 | |
| TCEP | Thermo Fisher Scientific | 77720 | |
| TMTpro标记试剂 | -- | -- | |
| 质谱分析 | Orbitrap Fusion Lumos质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 固定成像 | 甲醛（无甲醇） | EMS | 50-980-487 |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| ProLong Glass防淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | P36982 | |
| PROTEOSTAT聚集体检测试剂盒 | Enzo | ENZ-51035 | |
| 线粒体标记 | MitoTracker深红FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 |
| 活细胞成像 | FluoroBrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | -- |
| μ-Slide 8孔高壁培养皿 | ibidi | 80806 | |
| LPS包被磁珠 | 链霉亲和素Dynabeads | Thermo Fisher Scientific | 65305 |
| 生物素化LPS | Invivogen | tlrl-lpsbiot | |
| Alexa594-生物胞素 | Thermo Fisher Scientific | A12922 | |
| STED显微镜 | Abberior STEDYCON双色STED显微镜 | Abberior Instruments | -- |
| ProLong Gold防淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | P36930 | |
| STAR红和STAR橙二抗 | Abberior | -- | |
| TIRF显微镜 | 尼康Ti倒置显微镜 | Nikon | -- |
| Andor Zyla 4.2 Plus sCMOS相机 | Andor | -- | |
| 重组蛋白生产 | 谷胱甘肽琼脂糖4 Fast Flow树脂 | GE Healthcare | 17513201 |
| PreScission蛋白酶 | GE Healthcare | 27084301 | |
| 抗体生产 | Affigel | Bio-Rad | 1536099 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和分化 | THP-1细胞用50 ng/ml PMA分化3天，静息2天；iBMDM和HEK293T培养条件。 阅读提示：Methods: Cell and bacteria culture, infections and treatments |
| TLR刺激 | LPS浓度100 ng/ml；Pam3CSK4浓度400 ng/ml（未明确，需核对）；其他TLR配体浓度。 阅读提示：Methods: Cell and bacteria culture, infections and treatments |
| 感染模型 | L. monocytogenes 10403S菌株；MOI=10（活细胞成像30）；庆大霉素40 μg/ml；感染时间。 阅读提示：Methods: Cell and bacteria culture, infections and treatments |
| 基因编辑 | CRISPaint敲入参数（电转电压、脉冲）；sgRNA序列；供体质粒浓度。 阅读提示：Methods: Generation of MyD88-AGF knock-in cells |
| CRISPR敲除 | sgRNA设计；慢病毒转导；嘌呤霉素筛选浓度（1 μg/ml THP-1, 7.5 μg/ml iBMDM）。 阅读提示：Methods: Generation of knockout cells with CRISPR-Cas9 |
| 蛋白质组学 | 生物素酚浓度（2.5 mM THP-1, 5 mM iBMDM）；H2O2处理时间（30秒）；质谱仪器设置。 阅读提示：Methods: Myddosome mapping using spatiotemporally resolved proteomics |
| 显微镜成像 | 共聚焦显微镜设置（像素大小65 nm；pinhole 89.3）；FRAP参数；STED成像参数。 阅读提示：Methods: Live-cell confocal microscopy, STED microscopy, Myddosome FRAP |