鉴定NLRP3相互作用蛋白
寻找参与NLRP3激活的潜在分子
用抗NLRP3抗体免疫沉淀LPS刺激的小鼠PMs裂解物，通过质谱鉴定HERC6为NLRP3相互作用蛋白。
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HERC酶介导的NLRP3 ISGylation促进炎症模型中的炎症小体激活
Posttranslational ISGylation of NLRP3 by HERC enzymes facilitates inflammasome activation in models of inflammation
实验完整度
高包含体外细胞实验（HEK293T、THP-1、小鼠PMs）、体内动物模型（LPS诱导的败血症和ARDS模型、VSV感染模型）以及机制验证（ISGylation、泛素化分析、突变体实验）。
主要模型
小鼠原代腹腔巨噬细胞（PMs） THP-1细胞 HEK293T细胞 小鼠LPS诱导的ARDS模型 小鼠VSV感染模型
重点核对
HERC6/HERC5基因敲除或敲低对NLRP3表达和炎症小体激活的影响 LPS刺激和ATP/Nig刺激对NLRP3 ISGylation的动态影响 NLRP3 K799R突变对ISGylation和泛素化的影响 体内模型中LPS或VSV注射剂量和时间
摘要
含有NOD、LRR和pyrin结构域的蛋白3（NLRP3）炎症小体是先天免疫系统的关键组成部分，可启动炎症反应。NLRP3的翻译后修饰（PTM），包括泛素化和磷酸化，控制炎症小体激活并决定炎症强度。然而，其他PTM在控制NLRP3炎症小体激活中的作用仍不清楚。本研究发现TLR启动诱导NLRP3 ISGylation（一种ISG15共价结合靶蛋白的PTM）以稳定NLRP3蛋白。以SARS-COV-2感染为代表的病毒感染和I型干扰素诱导ISG15和主要E3 ISGylation连接酶HECT结构域和RCC1样结构域包含蛋白（HERCs；人类HERC5和小鼠HERC6）的表达。HERCs促进NLRP3 ISGylation并抑制K48连接的泛素化和蛋白酶体降解，从而增强NLRP3炎症小体激活。一致地，Herc6缺陷改善NLRP3依赖性炎症以及病毒感染引起的过度炎症。结果阐明了I型干扰素反应控制炎症小体激活和病毒感染诱导的异常NLRP3激活的机制。这项工作将ISGylation确定为NLRP3的一种PTM，揭示了一个调节NLRP3依赖性免疫病理的启动靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- I型干扰素反应如何通过ISGylation调控NLRP3炎症小体激活？
- 核心机制
- HERCs（HERC5/HERC6）催化NLRP3的ISGylation，抑制其K48连接的泛素化和蛋白酶体降解，从而稳定NLRP3蛋白并增强炎症小体激活。
- 主要证据
- 通过免疫共沉淀和质谱鉴定HERC6与NLRP3相互作用；体外ISGylation实验证明HERC5直接ISG化NLRP3；Herc6缺陷小鼠中NLRP3蛋白水平降低，炎症小体激活减弱，体内模型证实Herc6缺陷减轻炎症。
- 研究意义
- 揭示I型干扰素与炎症反应之间的串扰机制，为治疗NLRP3过度激活相关疾病（如COVID-19）提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证HERCs与NLRP3的相互作用
确认HERCs与NLRP3在生理条件下的结合
通过共转染和Co-IP实验检测HERC6/HERC5与NLRP3的结合，并在LPS刺激的PMs和THP-1细胞中验证内源性相互作用。
评估HERC6对NLRP3炎症小体激活的功能影响
确定HERC6是否选择性促进NLRP3炎症小体激活
使用Herc6敲除小鼠PMs或siRNA敲低HERC6，检测NLRP3激活剂（ATP、Nig、alum、MSU）诱导的IL-1β分泌和CASP1切割。
研究HERCs对NLRP3蛋白稳定性的影响
验证HERCs是否通过抑制蛋白酶体降解来稳定NLRP3
检测Herc6缺陷或HERC5敲低对NLRP3蛋白水平的影响，并进行CHX追踪实验和MG132处理实验。
证明HERCs促进NLRP3 ISGylation
确定HERCs是否通过ISGylation修饰NLRP3
在HEK293T细胞中重构ISGylation级联反应，检测HERC5对NLRP3 ISGylation的影响，并进行体外ISGylation实验。
鉴定NLRP3 ISGylation位点
确定负责ISGylation和泛素化的关键赖氨酸残基
通过构建NLRP3截短体和点突变体，鉴定K799为ISGylation和泛素化的关键位点。
体内验证Herc6缺陷对炎症的影响
评估Herc6缺陷在体内对NLRP3依赖性和病毒诱导炎症的影响
使用LPS诱导的败血症和ARDS模型，以及VSV感染模型，比较WT和Herc6缺陷小鼠的炎症反应。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Invitrogen | -- |
| RPMI培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | Invitrogen | -- | |
| 细胞刺激 | 脂多糖 | MilliporeSigma | L4130 |
| 三磷酸腺苷 | MilliporeSigma | A1852 | |
| 尼日利亚霉素钠盐 | MilliporeSigma | N7143 | |
| 尿酸钠晶体 | Invivogen | tlrl-msu-25 | |
| 明矾 | Thermo Fisher Scientific | 77161 | |
| 鞭毛蛋白 | Invivogen | tlrl-epstfla | |
| 聚(dA:dT) | Invivogen | tlrl-patn | |
| MG132 | MilliporeSigma | C2211 | |
| 细胞因子处理 | 重组小鼠IL-1β | PeproTech China | 211-11B |
| 小鼠IFN-β | Sino Biological | 50708-MCCH | |
| 病毒 | 水疱性口炎病毒-GFP | -- | -- |
| 抗体 | 抗Myc抗体 | MilliporeSigma | M4439 |
| 抗HA抗体 | MilliporeSigma | H3663 | |
| 抗Flag M2抗体 | MilliporeSigma | F1804 | |
| 抗NLRP3抗体 | Abcam | ab263899 | |
| 抗ASC抗体 | AdipoGen | AG-25B-0006 | |
| 抗caspase-1 p20抗体 | AdipoGen | AG-20B-0042 | |
| 抗HERC6抗体 | Abcam | ab22553 | |
| 抗HERC5抗体 | Proteintech | 22692-1-AP | |
| 抗ISG15抗体 | Cell Signaling Technology | 2743 | |
| 抗泛素抗体 | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-8017 | |
| 免疫沉淀 | 蛋白G琼脂糖 | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-2002 |
| 转染 | 脂质体转染试剂2000 | Invitrogen | -- |
| X-tremeGENE HP DNA转染试剂 | MilliporeSigma | 6366244001 | |
| INTERFERin转染试剂 | Polyplus Transfection | -- | |
| ELISA | 小鼠IL-1β ELISA试剂盒 | Dakewe Biotech Company | 1210123 |
| 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | Dakewe Biotech Company | 1217202 | |
| 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | Dakewe Biotech Company | 1210603 | |
| RNA提取 | RNAfast200 RNA提取试剂盒 | Fastagen Biotech | -- |
| TRIzol试剂 | Invitrogen | -- | |
| RT-qPCR | SYBR RT-PCR试剂盒 | Roche | -- |
| Applied Biosystems StepOnePlus实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 体外ISG化检测 | TNT快速偶联转录/翻译系统 | Promega | -- |
| 蛋白质印迹 | Amicon Ultra 10K超滤管 | MilliporeSigma | -- |
| RIPA裂解液 | Pierce | -- | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | MilliporeSigma | -- | |
| 硝酸纤维素膜 | -- | -- | |
| ImageJ软件 | NIH | -- | |
| 体外ISG化检测 | 重组人ISG15蛋白 | R&D Systems | UL-601 |
| 重组人ISG15 E1/UBE1L蛋白 | R&D Systems | E-309 | |
| 重组人UBCH8/UBE2L6蛋白 | R&D Systems | E2-644-100 | |
| 10×泛素结合反应缓冲液 | R&D Systems | -- | |
| 纯化的重组NLRP3 | Origene | WX030FB0 | |
| 质粒构建 | KOD-Plus-突变试剂盒 | Toyobo | -- |
| 动物实验 | 脂多糖 | MilliporeSigma | L4130 |
| 水疱性口炎病毒 | -- | -- | |
| 试剂 | NP-40 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与刺激 | LPS浓度（小鼠PMs 200 ng/mL，THP-1和MEF 1 μg/mL）、ATP浓度（2.5 mM）、Nigericin浓度（10 μM）、MSU浓度（250 μg/mL）、Alum浓度（2 mg/mL）、Flagellin浓度（500 ng/mL）、poly(dA:dT)浓度（200 ng/mL）、MG132浓度（10 μM） 阅读提示：Methods中Stimulants and viruses部分 |
| 基因敲除或敲低 | Herc6基因敲除小鼠（C57BL/6背景）、siRNA序列（Herc6、Isg15、HERC5）及转染时间（48小时） 阅读提示：Methods中Mice部分和RNA interference assay部分 |
| 体内模型 | LPS剂量（败血症模型25 mg/kg，ARDS模型10 mg/kg）、VSV剂量（5×10^8 PFU/只）、给药途径（腹腔注射）、观察时间（4小时、12小时、16小时） 阅读提示：Methods中LPS-induced sepsis model、LPS-induced ARDS model、Viral pathogenesis in mice部分 |
| NLRP3 ISGylation检测 | LPS刺激时间（4小时）、MG132处理（10 μM，4小时）、Co-IP抗体（抗NLRP3）、细胞裂解条件（SDS裂解缓冲液） 阅读提示：Methods中Co-IP部分和免疫印迹分析部分 |
| 小鼠品系与饲养 | C57BL/6小鼠来源、Herc6缺陷小鼠、Ifnar缺陷小鼠、Nlrp3缺陷小鼠、饲养条件（SPF级、12小时光照/12小时黑暗、温度18-22°C、湿度45-65%） 阅读提示：Methods中Mice部分 |