PROX1表达分析
确定PROX1在前列腺癌谱系可塑性连续过程中的表达模式及其与患者预后的关联。
在多个患者队列中分析PROX1 mRNA表达，比较不同分子亚型（ARPC、amphicrine、AR活性低、DNPC、NEPC），并进行生存分析。
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PROX1是前列腺癌谱系可塑性的早期驱动因子
PROX1 is an early driver of lineage plasticity in prostate cancer
实验完整度
高涵盖患者肿瘤、PDX、细胞系多模型，包括表达分析、甲基化调控、功能敲低、体内药效及IP-MS机制验证。
主要模型
NCI-H660细胞系 LASCPC-01细胞系 MSKPCa16类器官 LTL331/331R PDX模型
重点核对
PROX1在患者肿瘤、PDX和细胞模型中的表达模式（RNA-Seq/RT-qPCR/Western blot/IHC） PROX1启动子甲基化状态（WGBS/MSPCR）及dAza处理对PROX1表达的影响 PROX1敲低（Dox诱导shRNA）对NEPC和DNPC细胞活力、凋亡和分化标志物的影响 HDAC抑制剂（fimepinostat、romidepsin）对PROX1蛋白水平和细胞活力的影响 BCaP-1 PDX体内模型中HDAC抑制剂的肿瘤生长抑制效果
摘要
谱系可塑性被认为是前列腺癌致死性和对AR通路抑制剂耐药的关键决定因素。谱系可塑性是一个连续过程，范围从AR活性低的肿瘤、不表达神经内分泌前列腺癌（NEPC）程序的AR阴性肿瘤（即双阴性前列腺癌[DNPC]），到AR阴性的NEPC肿瘤。在谱系可塑性早期上调的因子尚未得到充分表征。阐明这些因子对于识别正在经历谱系可塑性或有此风险的肿瘤至关重要。我们整合分析了转移性前列腺癌患者肿瘤、患者来源异种移植瘤和细胞模型，确定PROX1在谱系可塑性连续过程早期上调，并随着肿瘤失去AR活性而逐渐增加。我们确定DNA甲基化是PROX1表达的关键调控因子。在DNPC和NEPC中抑制PROX1可降低细胞存活并影响凋亡和分化，证明PROX1的功能重要性。PROX1不能通过标准药物开发方法直接靶向。然而，亲和免疫纯化表明组蛋白去乙酰化酶（HDAC）是PROX1最突出的相互作用蛋白之一；HDAC抑制可耗竭PROX1，并在DNPC和NEPC中重现PROX1抑制的效果。总之，我们的结果表明PROX1促进谱系可塑性的出现，HDAC抑制是治疗跨越谱系可塑性连续过程的肿瘤的有前景的方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PROX1是否在前列腺癌谱系可塑性早期驱动因子中发挥作用，以及能否通过HDAC抑制靶向PROX1？
- 核心机制
- PROX1通过DNA甲基化调控（去甲基化）上调，促进谱系可塑性；PROX1与HDAC（如HDAC1/2）相互作用，HDAC抑制可降低PROX1蛋白稳定性并抑制肿瘤生长。
- 主要证据
- 患者肿瘤和PDX中PROX1在AR活性低/DNPC/NEPC中上调；PROX1敲低降低NEPC和DNPC细胞存活并诱导凋亡；HDAC抑制降低PROX1蛋白水平并抑制BCaP-1 PDX生长。
- 研究意义
- PROX1是谱系可塑性的早期标志物和治疗靶点，HDAC抑制有望用于治疗PROX1高表达的谱系可塑性前列腺癌。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
PROX1表达验证
在患者来源的细胞系和PDX模型中验证PROX1的表达模式，并检查其随去势治疗的时间动态变化。
使用RT-qPCR和Western blot检测细胞系，IHC和RNA-Seq检测PDX，并分析LTL331到LTL331R转分化过程中PROX1的动态。
PROX1表观遗传调控
确定DNA甲基化是否调控PROX1表达。
分析患者肿瘤和PDX中PROX1启动子甲基化状态，用dAza处理ARPC细胞系观察PROX1表达变化，并用MSPCR验证。
PROX1功能验证
验证PROX1在NEPC和DNPC中的功能重要性，以及其与AR表达的相互关系。
在NEPC和DNPC细胞系中用Dox诱导shRNA敲低PROX1，检测细胞活力、凋亡、增殖和分化标志物；在ARPC细胞中过表达PROX1，检测AR和NEPC标志物。
HDAC相互作用与抑制
验证PROX1与HDAC的相互作用，并评估HDAC抑制剂对PROX1表达及肿瘤生长的作用。
通过免疫沉淀-质谱鉴定PROX1相互作用蛋白，用HDAC抑制剂（fimepinostat、romidepsin、entinostat）处理NEPC/DNPC模型，检测PROX1水平、细胞活力和体内肿瘤生长。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | NCI-H660细胞系（CRL-5813） | ATCC | CRL-5813 |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| 药物处理 | 地西他滨（5-氮杂-2′-脱氧胞苷） | MedChemExpress | HY-A0004 |
| 菲美司他 | MedChemExpress | HY-13522 | |
| 罗米地辛 | MedChemExpress | HY-15149 | |
| 恩替诺特 | Selleck Chemicals | S1053 | |
| 诱导表达 | 多西环素盐酸盐 | MilliporeSigma | D9891 |
| 免疫组织化学 | PROX1抗体（克隆D2J6J，兔单克隆抗体14963） | Cell Signaling Technologies | 14963 |
| 靶标修复液 | Agilent | S1700 | |
| UltraVision Quanto检测系统 | Fisher Scientific | TL060QHD | |
| Invitrogen Biotin XX Tyramide SuperBoost试剂盒 | Fisher Scientific | B40931 | |
| Ventana DP 200玻片扫描仪 | Roche | -- | |
| 多重免疫荧光 | PSA抗体（2475T） | Cell Signaling Technology | 2475T |
| INSM1抗体（sc-271408） | Santa Cruz Biotechnology | sc-271408 | |
| AR抗体（5153T） | Cell Signaling Technology | 5153T | |
| PowerVision Poly-HRP抗兔或抗鼠二抗 | Leica | -- | |
| 柠檬酸盐缓冲液 | Vector Laboratories | H-3300-250 | |
| ProLong封片剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 尼康Eclipse E800显微镜 | Nikon | -- | |
| 染色质免疫沉淀 | 抗H3K27ac抗体（39133） | Active Motif | 39133 |
| 兔IgG（12-370） | Millipore | 12-370 | |
| Bioruptor Pico超声破碎仪 | Diagenode | -- | |
| 蛋白A/G磁珠（26162） | Thermo Fisher Scientific | 26162 | |
| Chelex-100树脂（1421253） | Bio-Rad | 1421253 | |
| 蛋白酶K（AM2546） | Invitrogen | AM2546 | |
| SYBRGreen PCR预混液（4312704） | Thermo Fisher Scientific | 4312704 | |
| Quantstudio 3或Quantstudio 5热循环仪 | Applied Biosystems | -- | |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测（CK04） | Dojindo Laboratories | CK04 |
| CellTiter-Glo 3D细胞活力检测试剂盒（G9683） | Promega | G9683 | |
| 凋亡检测 | Annexin V（550475） | BD Biosciences | 550475 |
| 碘化丙啶（P4864） | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| LSRFortessa II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 增殖检测 | Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647流式细胞术检测试剂盒（C10634） | Thermo Fisher Scientific | C10634 |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂（L3000008） | Thermo Fisher | L3000008 |
| 基因敲低 | tet-PLKO-puro载体（21915） | Addgene | 21915 |
| RNA提取与RT-qPCR | RNeasy Plus Mini试剂盒（74034） | QIAGEN | 74034 |
| High-Capacity cDNA反转录试剂盒（4368814） | Life Technologies | 4368814 | |
| TaqMan Universal PCR预混液（4304437） | Thermo Fisher Scientific | 4304437 | |
| Western blot | SDS-PAGE预制胶（NP0335BOX） | Thermo Fisher Scientific | NP0335BOX |
| Chemidoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 抗NCAM1/CD56抗体（3576） | Cell Signaling Technology | 3576 | |
| 抗CHGA抗体（60893） | Cell Signaling Technology | 60893 | |
| 抗SYP抗体（sc-17750） | Santa Cruz Biotechnology | sc-17750 | |
| 抗CHD4抗体（14173-1-AP） | Proteintech | 14173-1-AP | |
| 抗GAPDH抗体（2118） | Cell Signaling Technology | 2118 | |
| 抗肌动蛋白抗体（A5441） | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| DNA甲基化分析 | DNeasy Blood & Tissue试剂盒（69504） | QIAGEN | 69504 |
| EZ DNA Methylation-Gold试剂盒（D5006） | Zymo | D5006 | |
| Platinum II Taq Hot-Start DNA聚合酶试剂盒（14966005） | Invitrogen | 14966005 | |
| 琼脂糖（16500-100） | Invitrogen | 16500-100 | |
| RNA测序 | Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- |
| 动物实验 | NSG小鼠（005557） | The Jackson Laboratory | 005557 |
| Captisol（HY-17031） | MedChemExpress | HY-17031 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基、培养条件 阅读提示：Methods：Cell lines and PDXs |
| 药物处理 | dAza浓度（400 nM）、处理时间（5天）、溶剂（DMSO） 阅读提示：Results 图3E，Methods：Chemicals |
| 基因敲低 | shRNA序列、Dox浓度（1 μg/mL）、诱导时间（8天）、敲低效率验证 阅读提示：Methods：Short hairpin sequences used for PROX1 knockdown |
| 细胞活力检测 | CCK-8检测时间点、细胞数、重复数 阅读提示：Methods：Cell viability assay |
| 凋亡检测 | Annexin V/PI染色、流式细胞仪设置、处理时间 阅读提示：Methods：Apoptosis assay |
| 体内药效实验 | BCaP-1 PDX模型、给药剂量、频率、途径、治疗周期、动物品系 阅读提示：Methods：In vivo antitumor study |
| HDAC抑制剂处理 | fimepinostat浓度（5 nM）、romidepsin浓度（2 nM）、entinostat浓度（500 nM）、处理时间（48小时） 阅读提示：Results 图6C，Methods：Dose-response experiments |
| 免疫沉淀-质谱 | LASCPC-01细胞、PROX1抗体、质谱方法 阅读提示：Supplemental Methods |