鉴定FGL1乙酰化修饰及位点
确定FGL1是否存在乙酰化修饰，并鉴定主要乙酰化位点。
在HEK293T细胞中过表达Flag-FGL1，结合去乙酰化酶抑制剂处理，用乙酰化抗体检测乙酰化水平；通过赖氨酸点突变筛选确定乙酰化位点；用位点特异性抗体和质谱确认Lys 98。
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靶向纤维蛋白原样蛋白1增强肝细胞癌的免疫治疗
Targeting fibrinogen-like protein 1 enhances immunotherapy in hepatocellular carcinoma
实验完整度
高包含体外细胞实验、体内动物模型及临床样本分析等多层级验证，明确功能验证和机制验证。
主要模型
HEK293T细胞 HCC细胞系（HCCLM3、SMMC-7721、Huh7等） Hepa 1-6和H22同系小鼠肿瘤模型 HCC患者组织样本
重点核对
FGL1 Lys 98乙酰化修饰及其对蛋白稳定性的影响（通过突变、特异性抗体、质谱验证） SIRT2作为FGL1去乙酰化酶的作用（过表达、敲低、敲除及抑制剂AGK2） AGK2或阿司匹林处理对FGL1降解及T细胞杀伤功能的影响（体外共培养和杀伤实验） AGK2或阿司匹林与抗PD-L1联合治疗的体内抗肿瘤效果（Hepa 1-6和H22模型） 临床样本中SIRT2与FGL1表达及乙酰化水平的相关性及预后意义（免疫组化分析）
摘要
癌细胞如何逃避免疫检查点阻断的治疗效果在很大程度上是未知的。在此，我们报道纤维蛋白原样蛋白1（FGL1），一种新发现的免疫检查点配体，在肝细胞癌（HCC）中第98位赖氨酸（Lys 98）处被乙酰化修饰，这使其被靶向蛋白酶体降解。Sirtuin 2（SIRT2）去乙酰化并稳定FGL1，从而促进免疫逃逸。值得注意的是，SIRT2抑制剂2-氰基-3-[5-(2,5-二氯苯基)-2-呋喃基]-N-5-喹啉基-2-丙烯酰胺（AGK2）在体外增强了FGL1的乙酰化并降低了FGL1蛋白水平。AGK2与程序性死亡配体1（PD-L1）阻断联合治疗有效抑制了肿瘤生长并提高了小鼠的总生存率。此外，阿司匹林，一种老药，可以在体外直接乙酰化FGL1的Lys 98并促进其降解。阿司匹林增强了免疫治疗的功效，诱导肿瘤消退，并延长了荷瘤小鼠的寿命。此外，SIRT2/FGL1轴在HCC标本中表达。总的来说，这些发现揭示了FGL1的乙酰化介导的调控，确定了HCC免疫治疗的潜在靶点，并为HCC的临床治疗提供了治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- FGL1如何通过翻译后修饰调控其蛋白稳定性，进而影响HCC的免疫逃逸和对免疫检查点阻断疗法的应答。
- 核心机制
- SIRT2通过去乙酰化FGL1的Lys 98，稳定FGL1蛋白，从而抑制T细胞活化，促进免疫逃逸；AGK2抑制SIRT2或阿司匹林直接乙酰化FGL1 Lys 98，促进其蛋白酶体降解，增强PD-L1阻断的疗效。
- 主要证据
- 体外实验表明SIRT2去乙酰化FGL1并增加其稳定性，AGK2或阿司匹林诱导FGL1降解并增强T细胞杀伤；体内实验中，AGK2或阿司匹林联合抗PD-L1显著抑制肿瘤生长并延长生存期；临床样本显示SIRT2与FGL1表达正相关，与乙酰化水平负相关，且与预后相关。
- 研究意义
- 揭示SIRT2/FGL1轴作为HCC免疫治疗的潜在靶点，为增强抗PD-1/PD-L1疗效提供联合治疗策略，并提示SIRT2、FGL1及乙酰化水平可作为预后标志物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证乙酰化促进FGL1蛋白酶体降解
探究FGL1乙酰化对其蛋白稳定性和降解途径的影响。
用NAM处理多种HCC细胞系，检测FGL1蛋白和mRNA水平；用蛋白酶体、溶酶体和自噬抑制剂处理，观察FGL1降解途径；通过泛素化实验和CHX追踪实验分析降解速率。
鉴定SIRT2为FGL1去乙酰化酶
筛选并验证负责FGL1 Lys 98去乙酰化的SIRT家族成员。
在HCC细胞中过表达SIRTs，检测FGL1蛋白水平；通过共免疫沉淀和免疫印迹验证相互作用；通过SIRT2野生型、催化突变体、抑制剂AGK2和siRNA敲低，检测FGL1乙酰化和泛素化水平。
评估AGK2对T细胞活性的影响
验证通过AGK2抑制SIRT2降低FGL1水平是否增强T细胞抗肿瘤活性。
建立肝癌细胞与活化T细胞的体外共培养体系；用PHA活化Jurkat细胞，检测IL-2 mRNA；进行T细胞杀伤实验。
验证AGK2联合PD-L1阻断的体内疗效
检验AGK2与抗PD-L1抗体联合治疗在体内对HCC肿瘤生长和生存期的影响。
使用Hepa 1-6和H22同系小鼠模型，分别给予AGK2、抗PD-L1或联合治疗；监测肿瘤生长和生存期；通过免疫印迹和免疫组化分析FGL1水平、CD8+ T细胞浸润和颗粒酶B表达。
验证阿司匹林诱导FGL1乙酰化和降解
探究阿司匹林是否能直接乙酰化FGL1并促进其降解，及其对T细胞活性的影响。
体外重组FGL1蛋白与阿司匹林孵育，检测乙酰化；用质谱确认Lys 98乙酰化；处理多种细胞，检测FGL1蛋白水平、泛素化及降解途径；在共培养体系中检测IL-2 mRNA和T细胞杀伤。
评估阿司匹林联合PD-L1阻断的体内疗效
验证阿司匹林与抗PD-L1联合治疗在体内是否增强抗肿瘤免疫。
在Hepa 1-6和H22模型中，给予阿司匹林、抗PD-L1或联合治疗；监测肿瘤生长和生存期；检测FGL1表达和免疫浸润。
分析SIRT2和FGL1乙酰化与临床病理特征的相关性
探讨SIRT2与FGL1乙酰化水平在HCC组织中的相关性及其预后意义。
对HCC组织微阵列进行免疫组化染色，检测SIRT2、总FGL1和乙酰化K98-FGL1水平；分析其与肿瘤分期、大小和患者生存期的相关性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Meilun Biotechnology | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 细胞转染 | EZ-trans转染试剂 | Life-iLab | -- |
| 病毒感染 | 聚凝胺 | -- | -- |
| 药物处理 | 曲古抑菌素A | -- | -- |
| 烟酰胺 | -- | -- | |
| AGK2 | TargetMol | -- | |
| 阿司匹林 | Ouhe Technology | -- | |
| 质粒构建 | KOD Fx DNA聚合酶 | TOYOBO | -- |
| DpnI限制酶 | Takara | -- | |
| NcmDH5-α感受态细胞 | NCM Biotech | -- | |
| RNA提取 | EZ-press RNA纯化试剂盒 | EZ Bioscience | -- |
| RT-qPCR | 4×反转录预混液 | EZ Bioscience | -- |
| 2× SYBR qPCR预混液 | AlpaLife | -- | |
| Applied Biosystems 7300 Plus序列检测系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 免疫印迹 | 蛋白酶抑制剂混合物 | ApexBio | -- |
| 抗乙酰化赖氨酸抗体 | Cell Signaling Technology | 9441 | |
| 抗FGL1抗体 | Proteintech | 16000-1-AP | |
| 抗FGL2抗体 | Proteintech | 67152-1-Ig | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 抗SIRT2抗体 | Abcam | ab211033 | |
| 抗LAG-3抗体 | Proteintech | 16616-1-AP | |
| 抗His抗体 | HUABIO | R1207-2 | |
| 抗Flag抗体 | AbHO | HOA012FL01 | |
| 抗HA抗体 | AbHO | HOA012HA01 | |
| 抗乙酰化K98 FGL1抗体 | ABclonal Technology Biotech | -- | |
| HRP标记的抗小鼠二抗 | Signalway Antibody | L3032 | |
| HRP标记的抗兔二抗 | Signalway Antibody | L3012 | |
| 免疫沉淀 | 抗Flag磁珠 | AbHO | HOA032FL01 |
| Protein G琼脂糖凝胶 | GE Healthcare | 17-0618-01 | |
| 免疫印迹 | Tanon 5200成像系统 | Tanon | -- |
| 蛋白沉淀 | TCA蛋白沉淀试剂盒 | Sangon Biotech | -- |
| ELISA | 人FGL1 ELISA试剂盒 | CUSABIO Technology | -- |
| RNA干扰 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | -- |
| T细胞培养 | ImmunoCult-XF T细胞扩增培养基 | STEMCELL Technologies | 10981 |
| T细胞活化 | ImmunoCult人CD3/CD28/CD2 T细胞活化剂 | STEMCELL Technologies | 10970 |
| T细胞培养 | 白细胞介素-2 | Pepro Tech | -- |
| T细胞杀伤实验 | 抗CD3抗体 | eBioscience, Thermo Fisher Scientific | 160027 |
| LAG-3阻断 | 瑞拉利单抗 | Selleck Chemicals | A2029 |
| 对照抗体 | 对照IgG | Sino Biological | HG4K |
| 质谱分析 | TIMS-TOF Pro质谱仪 | Bruker Daltonics | -- |
| 动物实验 | 抗PD-L1单克隆抗体 | -- | -- |
| 免疫组化 | 脱蜡液 | Solarbio Life Science | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| FGL1乙酰化检测 | 去乙酰化酶抑制剂的浓度和处理时间（TSA 5 μM, 16 h；NAM 10 mM, 6 h）；Flag-FGL1稳定表达细胞株 阅读提示：Methods: Cell culture, transfection, virus infection, and treatments；Figure 1A-C |
| FGL1降解机制 | 蛋白酶体抑制剂MG132使用条件（浓度和时间）；FGL1蛋白半衰期测定（CHX浓度100 μg/mL） 阅读提示：Methods: Cell culture, transfection, virus infection, and treatments；Figure 1J-L; Supplemental Figure 1 |
| SIRT2去乙酰化实验 | SIRT2过表达或敲低的效率验证；SIRT2催化失活突变体（H187Y）；AGK2处理浓度和时间 阅读提示：Methods: Cell culture, transfection, virus infection, and treatments; Plasmids; RNA interference；Figure 2 |
| 体外T细胞功能实验 | 共培养体系中肿瘤细胞预处理浓度和时间；Jurkat细胞活化条件（PHA 500 ng/mL, 72 h）；共培养比例和时长；T细胞杀伤实验中效应和靶细胞比例 阅读提示：Methods: Coculture experiments; T cell–mediated tumor cell–killing assay；Supplemental Figure 3 |
| 体内联合治疗实验 | 肿瘤模型建立（细胞数量、注射部位）；药物剂量和方案（AGK2 10 mg/kg, i.p., 每周三次；阿司匹林 50 mg/kg, i.p., 每天一次；anti-PD-L1 100 μg, i.p., 指定天数）；分组和随机化方法；生存期终点标准 阅读提示：Methods: Animal experiments；Figure 3A-D, Figure 5A-D |
| 阿司匹林直接乙酰化实验 | 重组FGL1蛋白浓度、阿司匹林浓度（0.125-0.25 mM）和孵育时间（30 min）；质谱分析流程 阅读提示：Methods: Mass spectrometric analysis；Figure 4A-C |
| 临床样本分析 | 组织芯片的来源和样本数（94例HCC, 86例癌旁）；IHC染色评分标准；统计分析选择（t检验、Pearson相关、Kaplan-Meier） 阅读提示：Methods: Human tissue microarray analysis; Statistics；Figure 6 |