建立顺铂肾毒性小鼠模型
评估顺铂诱导的肾损伤及其与A2A受体表达上调的关联。
对小鼠给予急性（单次10 mg/kg）或亚慢性（3 mg/kg连续6天）顺铂腹腔注射，检测肾功能（BUN）、肾组织学损伤、损伤标志物（NGAL、KIM1）、炎症标志物（Tnfa、Il6）和凋亡标志物（Bax/Bcl2比例），并通过免疫荧光和qPCR检测A2A受体表达及其与肾损伤标志物的相关性。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
伊曲茶碱保护顺铂诱导的肾毒性和周围神经病变，同时保留顺铂抗肿瘤作用
Istradefylline protects from cisplatin-induced nephrotoxicity and peripheral neuropathy while preserving cisplatin antitumor effects
实验完整度
高包含急性、亚慢性、累积性顺铂肾毒性模型，肿瘤荷瘤小鼠模型（LLC1和mEERL），体外细胞实验，RNA-Seq转录组分析，功能验证（凋亡、脂质积累、氧化应激）和机制验证（铂积累与转运体表达）。
主要模型
C57BL6/J小鼠急性/亚慢性/累积性顺铂肾毒性模型 LLC1肺癌同系小鼠模型 mEERL HPV+鳞状细胞癌同系小鼠模型 RPTEC/hTERT1人肾近端小管上皮细胞系
重点核对
C57BL6/J小鼠（8-10周龄雄性） 急性模型：顺铂单次腹腔注射10 mg/kg 亚慢性模型：顺铂3 mg/kg腹腔注射6天 KW6002给药方案：3 mg/kg腹腔注射，急性模型前1天至后2天，亚慢性模型前5天至后7天 LLC1和H1975细胞系
摘要
顺铂是一种强效化疗药物，广泛用于治疗各种实体癌。然而，其临床有效性受到频繁严重不良反应的强烈限制，尤其是肾毒性和化疗诱导的周围神经病变。因此，迫切需要确定限制顺铂毒性的新策略。在本研究中，我们发现FDA批准的腺苷A2A受体拮抗剂伊曲茶碱（KW6002）在有或无肿瘤的小鼠中保护免受顺铂诱导的肾毒性和神经病理性疼痛。此外，我们还证明顺铂的抗肿瘤特性在荷瘤小鼠中未被伊曲茶碱改变，甚至可能被增强。总之，我们的结果支持使用伊曲茶碱作为接受顺铂治疗患者临床管理的一种有价值的预防方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- A2A受体拮抗剂伊曲茶碱（KW6002）能否在不影响顺铂抗肿瘤效果的前提下，减轻顺铂诱导的肾毒性和化疗诱导的周围神经病变？
- 核心机制
- KW6002通过抑制A2A受体，减轻肾脏炎症、凋亡、脂质积累和氧化应激，并上调肾脏外排转运体（如MATE1和ABCC2）以减少肾脏铂蓄积，从而保护肾功能；同时不影响肿瘤内铂浓度，甚至通过增强癌细胞对顺铂的敏感性及抗肿瘤免疫来增强其抗肿瘤效果。
- 主要证据
- 在多种小鼠模型（急性、亚慢性、累积性肾毒性模型及LLC1和mEERL荷瘤模型）中，KW6002显著降低BUN、NGAL、KIM1等肾损伤标志物，并减轻疼痛超敏反应；体外实验证实其减少RPTEC/hTERT1细胞凋亡和DNA损伤，但不削弱LLC1和H1975癌细胞对顺铂的凋亡反应；RNA-Seq和qPCR显示KW6002上调肾脏MATE1和ABCC2表达。
- 研究意义
- 鉴于KW6002已获FDA批准用于帕金森病治疗，且本研究显示其能有效减轻顺铂的肾毒性和周围神经病变而不影响抗肿瘤效果，支持将其临床重新定位为接受顺铂化疗的癌症患者的预防性治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估KW6002对顺铂肾毒性的保护作用
验证A2A受体拮抗剂KW6002是否能减轻顺铂诱导的肾损伤。
在急性、亚慢性和累积性顺铂模型中，给予KW6002（3 mg/kg腹腔注射），检测BUN、肾损伤标志物、组织学评分、炎症标志物和caspase 3/7活性。
转录组学分析揭示KW6002保护作用机制
在整体转录水平上探究KW6002减轻顺铂肾毒性的分子机制。
对亚慢性模型小鼠肾脏进行RNA-Seq分析，通过PCA、差异表达基因鉴定、GO/GSEA/IPA通路富集分析，揭示KW6002逆转顺铂诱导的基因表达变化，特别是细胞凋亡、脂质代谢和氧化应激相关通路。
体外验证KW6002对肾小管上皮细胞的保护作用
在体外确认KW6002对顺铂诱导的肾近端小管上皮细胞损伤的保护作用及其机制。
使用人肾近端小管上皮细胞系RPTEC/hTERT1，与顺铂（50 μM）和/或KW6002共处理，检测细胞活力、caspase 3/7活性、凋亡标志物（cleaved PARP、caspase 3、Bax/Bcl2）、DNA损伤（彗星实验）、脂质积累（油红O染色）和氧化应激（Nrf2、HO1表达和过氧化氢酶活性）。
荷瘤小鼠模型验证KW6002不影响顺铂抗肿瘤效果
在肿瘤背景下评估KW6002对顺铂肾保护作用及对顺铂抗肿瘤功效的影响。
建立LLC1肺癌和mEERL HPV+鳞癌同系小鼠模型，给予顺铂和/或KW6002治疗，检测肾损伤标志物、肿瘤大小、肿瘤转录组变化以及肿瘤内γH2AX表达。
体外验证KW6002对癌细胞顺铂敏感性的影响
在体外评估KW6002是否影响顺铂对癌细胞的杀伤作用。
使用小鼠LLC1和人H1975肺癌细胞系，与顺铂和/或KW6002共处理，检测凋亡（caspase 3/7活性、cleaved PARP）、DNA损伤（γH2AX foci、彗星实验）和细胞周期相关蛋白表达。
探究KW6002对顺铂组织分布的影响
阐明KW6002差异调节肾脏和肿瘤顺铂蓄积的机制。
在体外细胞和体内荷瘤小鼠中分别检测肾脏和肿瘤组织的铂含量，并通过流式细胞术检测细胞外排能力，结合RNA-Seq分析肾脏和肿瘤中外排转运体表达变化。
评估KW6002对顺铂诱导的疼痛超敏反应的影响
验证KW6002能否减轻顺铂引起的神经病理性疼痛。
在亚慢性模型中，通过von Frey纤维丝检测小鼠机械性痛觉超敏，并检测背根神经节（DRG）中促炎细胞因子Il1b和Ccl2的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物处理 | 伊曲茶碱（KW6002） | Tocris | -- |
| 顺铂 | Accord Healthcare | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| F12培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RPMI GlutaMAX培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 三碘甲状腺原氨酸 | -- | -- | |
| 重组人EGF | -- | -- | |
| 抗坏血酸 | MilliporeSigma | -- | |
| 人转铁蛋白 | MilliporeSigma | -- | |
| 胰岛素 | MilliporeSigma | -- | |
| 前列腺素E1 | MilliporeSigma | -- | |
| 氢化可的松 | MilliporeSigma | -- | |
| G418 | MilliporeSigma | -- | |
| 碳酸氢钠 | MilliporeSigma | -- | |
| 基质胶 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | -- |
| 凋亡检测 | Caspase-Glo 3/7检测试剂盒 | Promega | -- |
| 过氧化氢酶活性检测 | 过氧化氢酶比色活性检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 细胞外排检测 | EFLUXX-ID绿色多药耐药检测试剂盒 | ENZO Life Sciences | -- |
| CytoFLEX LX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| 彗星实验 | 琼脂糖 | Bio-Rad | -- |
| 彗星载玻片 | R&D Systems | -- | |
| SYBR Green核酸染料 | Invitrogen | -- | |
| Axio Imager Z1 Apotome显微镜 | Zeiss | -- | |
| 油红O染色 | 油红O溶液 | Fisher Biotec | -- |
| 油红O溶液 | Merck | -- | |
| 甘油明胶水性封片剂 | MilliporeSigma | -- | |
| 免疫荧光 | 抗γH2AX (Ser139)抗体 | Cell Signaling Technology | 9718 |
| Alexa Fluor 488二抗 | Life Technologies | -- | |
| Leica DMI8显微镜 | Leica | -- | |
| 抗A2AR一抗 | Frontiers Institute | GP-Af1000 | |
| Signal Boost信号增强剂 | Cell Signaling Technology | 8114 | |
| Alexa Fluor 568偶联二抗 | Life Technologies | -- | |
| Lotus tetragonolobus FITC偶联物 | Vector Laboratories | FL-1321-2 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| Vectashield Vibrance抗淬灭封片剂 | Vector Laboratories | H-1700 | |
| Zeiss LSM 880共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| Zeiss LSM 710共聚焦激光扫描显微镜 | Zeiss | -- | |
| 驴血清 | MilliporeSigma | D9663 | |
| RNA提取 | RNeasy Mini试剂盒 | QIAGEN | -- |
| RNA-Seq | Illumina TruSeq链特异性mRNA文库制备试剂盒v2 | Illumina | -- |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| HiSeq 4000测序仪 | Illumina | -- | |
| RT-qPCR | High-capacity cDNA逆转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| TaqMan基因表达预混液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| StepOne实时荧光定量PCR仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 铂浓度测定 | 硝酸 | Carlo Erba | -- |
| AAnalyst 800原子吸收光谱仪 | Perkin Elmer | -- | |
| ICAP-Qc电感耦合等离子体质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | MilliporeSigma | -- |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | Pierce | -- | |
| NuPAGE Novex凝胶 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 抗cleaved caspase 3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| 抗cleaved PARP1抗体 | Cell Signaling Technology | 5625 | |
| 抗细胞周期蛋白D1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-718 | |
| 抗PCNA抗体 | Cell Signaling Technology | 13110 | |
| HRP偶联二抗 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| ECL Select化学发光试剂盒 | GE Healthcare | -- | |
| ImageQuant LAS 4000成像系统 | GE Healthcare | -- | |
| 抗GAPDH抗体 | MilliporeSigma | G9545 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 4970 | |
| 样本采集 | AU480生化分析仪 | Beckman Coulter | -- |
| RNA保存液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 行为学评估 | von Frey纤维丝 | -- | -- |
| 数据分析 | Kaluza分析软件 | Beckman Coulter | -- |
| ImageJ软件 | NIH | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 小鼠品系、年龄、性别；顺铂给药剂量、途径、频率和周期；KW6002给药剂量、途径、频率和周期 阅读提示：Methods: Animals and treatments; Supplemental Figure 1 |
| 肾损伤评估 | BUN检测方法；肾组织学评分标准；肾损伤标志物（NGAL, KIM1）和炎症标志物（Tnfa, Il6）的检测方法及引物 阅读提示：Methods: Sample collection, Renal histological analysis, RT-qPCR; Figure 1 and Figure 3 legends |
| RNA-Seq分析 | RNA提取和文库制备方法；测序平台；差异表达基因筛选阈值（adjusted P值和log2 fold change）；富集分析方法 阅读提示：Methods: RNA-Seq and analysis; Figure 4 legend |
| 体外细胞实验 | 细胞系来源和培养条件；顺铂和KW6002的浓度及处理时间；检测指标（细胞活力、凋亡、DNA损伤、脂质积累、氧化应激）的具体实验方法 阅读提示：Methods: Cell cultures, Cell viability assay, Caspase 3/7 activity, Catalase activity, Comet assay, Oil Red staining, Immunofluorescence (cells); Figure 5 and Figure 7 legends |
| 荷瘤模型建立与评估 | 细胞系（LLC1, mEERL）的来源和接种数量；肿瘤接种方式和部位；治疗开始时机和分组；肿瘤体积测量方法 阅读提示：Methods: LLC1 in vivo tumor model, mEERL in vivo tumor model; Figure 6 and Figure 10 legends |
| 疼痛行为学评估 | von Frey纤维丝型号和使用方法；测试时间点；疼痛阈值计算方法 阅读提示：Methods: Behavioral assessment; Figure 9 legend |
| 铂浓度和组织分布测定 | 样本处理（矿物化方法）；检测仪器（GF-AAS或ICP-MS）；结果归一化方式 阅读提示：Methods: Renal tissue and cell concentrations of platinum; Figure 8 legend |