建立肺移植耐受模型
建立小鼠肺移植耐受模型，为后续研究提供实验基础。
将BALB/c供体肺移植至经CSB处理的C57BL/6受者，至少30天后获得耐受移植物。
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维持移植物组织驻留的Foxp3+细胞对小鼠肺移植耐受是必要的
Maintenance of graft tissue-resident Foxp3+ cells is necessary for lung transplant tolerance in mice
实验完整度
高研究包含体外细胞实验、动物模型（小鼠肺移植和再移植模型）、患者样本分析及单细胞测序等多层级验证，并有功能缺失和机制研究。
主要模型
BALB/c供体肺移植至C57BL/6受者（经围手术期共刺激阻断处理） 小鼠肺再移植模型 Foxp3-DTR小鼠 人肺移植患者活检样本
重点核对
共刺激阻断（CSB）处理：抗CD40配体250 μg i.p. 和CTLA4-Ig 200 μg i.p.，分别在术后0天和2天给药 白喉毒素（DT）处理：250 ng i.p.，术后0、1、4天及每周 IL-33处理：重组小鼠IL-33 50 μg/50 μL，气管内给药，术后0、1、4天 抗CD20抗体处理：250 μg i.v.，再移植前1天；术后0、1、4天i.p.，IgG2c同型对照 PC61（抗CD25抗体）：500 μg i.p.术后0天，250 μg i.p.术后1和3天
摘要
介导同种异体移植物耐受的机制因器官而异。我们之前已经表明，在耐受的小鼠肺同种异体移植物中会诱导富含Foxp3+ T细胞的支气管相关淋巴组织(BALT)，并且这些Foxp3+细胞在局部和全身抑制同种免疫反应。在这里，我们证明了耐受肺同种异体移植物中驻留的Foxp3+细胞在外观和转录上与外周血中的不同，并且是克隆扩增的。使用小鼠肺再移植模型，我们表明受者Foxp3+细胞被持续募集到耐受移植物内的BALT中。我们确定了移植物驻留和新募集的Foxp3+细胞的区分特征，并表明移植物浸润的Foxp3+细胞随着时间的推移获得了类似于移植物驻留Foxp3+细胞的转录谱。当阻止受者Foxp3+细胞的募集时，同种异体移植物发生抗体介导的排斥反应和急性细胞排斥反应。最后，我们表明局部给予IL-33可以扩增和激活同种异体移植物驻留的Foxp3+细胞，为设计肺移植受者的耐受性疗法提供了一个平台。我们的研究结果确立了移植物驻留Foxp3+细胞作为肺移植耐受的关键协调者，并强调需要开发肺特异性的免疫抑制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 移植物驻留的Foxp3+细胞是否以及如何维持肺移植耐受？
- 核心机制
- 肺移植物驻留Foxp3+细胞通过产生双调蛋白（amphiregulin）作用于间皮细胞等基质细胞，维持组织稳态，防止排斥反应；这些Foxp3+细胞需要来自胸腺的持续补充以维持耐受。
- 主要证据
- 通过小鼠肺移植和再移植模型，结合单细胞RNA测序、TCR分析、流式细胞术、双光子显微镜、基因敲除小鼠及功能实验，证明移植物驻留Foxp3+细胞的独特表型和转录特征，以及IL-33局部给药的保护作用。
- 研究意义
- 本研究揭示了移植物驻留Foxp3+细胞在肺移植耐受中的关键作用，为开发肺特异性免疫抑制疗法提供了理论基础和潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
表征移植物驻留Foxp3+细胞
比较移植物驻留与外周Foxp3+细胞的表型和转录差异。
通过流式细胞术和单细胞RNA测序分析移植物和脾脏中Foxp3+细胞的表型（CD25、CD44、CD62L、CD69、PD-1）和转录组。
验证Foxp3+细胞的胸腺来源
验证移植物内Foxp3+细胞是否来源于胸腺而非外周转化。
检测Foxp3+细胞Helios和neuropilin-1表达，并进行过继转移实验。
研究Foxp3+细胞再募集
探究耐受移植物中Foxp3+细胞的持续补充机制。
使用再移植模型，通过双光子显微镜和单细胞RNA测序分析新募集的Foxp3+细胞。
耗竭受者Foxp3+细胞
确定受者来源Foxp3+细胞在维持耐受中的必要性。
使用Foxp3-DTR小鼠作为次级受者，通过DT处理选择性耗竭受者Foxp3+细胞，观察排斥反应。
验证B细胞在排斥中的作用
确定B细胞是否介导Foxp3+细胞耗竭后的排斥反应。
通过抗CD20抗体耗竭B细胞或使用AID/μS敲除小鼠，评估排斥反应的变化。
评估IL-33局部治疗效应
探究局部IL-33给药能否扩增并激活移植物驻留Foxp3+细胞，从而减轻排斥。
在耐受小鼠或再移植模型的气管内给予重组IL-33，分析Foxp3+细胞数量和表型，以及排斥反应程度。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 小鼠处理 | 抗CD40配体抗体 | Bio X Cell | -- |
| CTLA4免疫球蛋白 | Bio X Cell | -- | |
| 白喉毒素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 抗体处理 | 抗CD20中和抗体 | Bio X Cell | -- |
| PC61（抗CD25抗体） | Bio X Cell | -- | |
| 细胞因子处理 | 重组小鼠IL-33 | BioLegend | -- |
| 流式细胞术 | FACScan流式细胞仪 | BD | -- |
| Attune NxT声波聚焦流式细胞仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞分选 | MoFlo分选仪 | BD | -- |
| B细胞分选试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 细胞标记 | CMTMR（红色荧光染料） | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 组织学 | 甲醛 | -- | -- |
| 免疫荧光 | 兔抗小鼠多克隆CCSP抗体 | Seven Hills Bioreagent | WRAB-3950 |
| 山羊抗兔Alexa Fluor 488抗体 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Hoechst 33342核染料 | Invitrogen | H3570 | |
| 正常山羊血清 | Invitrogen | -- | |
| 免疫组化 | 兔抗小鼠多克隆C4d抗体 | Hycult Biotech | HP8033 |
| 生物素化山羊抗兔IgG | Vector Laboratories | BA-1000-1.5 | |
| VECTASTAIN ABC试剂盒 | Vector Laboratories | -- | |
| 非水溶性封片剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 免疫组化（人样本） | 大鼠抗人Foxp3抗体 | eBioscience | PCH101 |
| 兔抗双调蛋白抗体 | Bioss | bs-3847R | |
| 免疫组化 | Olympus BX61显微镜 | Olympus | -- |
| 单细胞RNA-seq | Chromium单细胞3'文库与凝胶微珠试剂盒 | 10x Genomics | -- |
| Chromium单细胞V(D)J试剂盒 | 10x Genomics | -- | |
| NovaSeq S4测序平台 | Illumina | -- | |
| CellRanger软件 | 10x Genomics | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 共刺激阻断 | 抗CD40配体250 μg i.p.和CTLA4-Ig 200 μg i.p.，术后0天和2天给药 阅读提示：见Methods中Mice and reagents部分 |
| 白喉毒素处理 | DT剂量250 ng i.p.，术后0、1、4天及每周 阅读提示：见Methods中Mice and reagents部分 |
| IL-33处理 | 重组IL-33剂量50 μg/50 μL，气管内给药，术后0、1、4天 阅读提示：见Methods中Mice and reagents部分及Figure 7 legend |
| 抗CD20处理 | 抗CD20抗体250 μg i.v.，再移植前1天；术后0、1、4天i.p.，IgG2c同型对照 阅读提示：见Methods中Mice and reagents部分 |
| PC61处理 | PC61剂量：500 μg i.p.术后0天，250 μg i.p.术后1和3天 阅读提示：见Methods中Mice and reagents部分 |