验证p38α在DSS诱导结肠炎中的作用
确定p38α在肠道炎症中对ILC3功能的影响
使用条件性敲除小鼠（VavicreMapk14fl/fl、RorccreMapk14fl/fl）诱导DSS结肠炎，观察疾病严重程度及ILC3细胞因子产生。
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p38α-eIF6-Nsun2轴促进ILC3的快速应答以保护宿主免受肠道炎症
p38α-eIF6-Nsun2 axis promotes ILC3's rapid response to protect host from intestinal inflammation
实验完整度
高研究涉及体外细胞实验、小鼠动物模型及机制验证，包括蛋白互作、mRNA定位及功能实验。
主要模型
小鼠DSS诱导结肠炎模型 ILC3细胞系MNK-3 原代小肠和结肠ILC3
重点核对
DSS诱导结肠炎模型中p38α磷酸化水平 ILC3中p38α、Nsun2或eIF6的缺失对细胞因子产生的影响 IL-1β刺激下IL-22和GM-CSF的mRNA核输出变化 eIF6与Nsun2、p38α的相互作用及对Nsun2甲基转移酶活性的影响 G3BP1对p38α磷酸化eIF6的促进作用
摘要
3型固有淋巴细胞（ILC3）对维持肠道稳态至关重要。受到刺激后，ILC3能迅速产生细胞因子以抵御感染和结肠炎。然而，ILC3快速应答的调控机制仍不清楚。本研究发现，在稳态下，eIF6与Nsun2及细胞因子mRNA在ILC3中聚集，抑制Nsun2的甲基转移酶活性及细胞因子mRNA的核输出，导致细胞因子mRNA滞留于细胞核。受到刺激后，磷酸化的p38α磷酸化eIF6，进而解除对Nsun2活性的抑制，促进细胞因子mRNA的核输出和细胞因子的快速产生。在ILC3中遗传性破坏p38α、Nsun2或eIF6会影响保护性细胞因子的mRNA核输出和蛋白表达，从而导致对结肠炎的易感性增加。综上，我们的数据揭示了p38α–eIF6–Nsun2轴在转录后水平调控ILC3快速免疫应答中的关键作用，这对肠道稳态维持和抵御肠道炎症至关重要。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ILC3如何快速响应环境刺激并产生细胞因子以维持肠道稳态？
- 核心机制
- p38α-eIF6-Nsun2轴通过调控细胞因子mRNA的核输出来促进ILC3快速产生细胞因子。
- 主要证据
- 通过在体小鼠模型和体外细胞实验，证实p38α磷酸化eIF6后促进Nsun2介导的m5C修饰，进而促进细胞因子mRNA核输出和蛋白产生。
- 研究意义
- 揭示ILC3快速免疫应答的转录后调控机制，为治疗肠道炎症性疾病提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
探究p38α对ILC3细胞因子产生的转录后调控
评估p38α是否影响ILC3细胞因子mRNA的核输出
分离并刺激ILC3，检测细胞因子mRNA和蛋白水平，通过细胞分级实验分析mRNA亚细胞定位。
鉴定p38α下游效应分子eIF6和Nsun2
确定p38α调控mRNA核输出的分子机制
通过TurboID邻近标记和质谱鉴定p38α相互作用蛋白，筛选出eIF6和Nsun2，并通过Co-IP、SPR等验证相互作用。
验证eIF6抑制Nsun2甲基转移酶活性
阐明eIF6如何调控Nsun2介导的m5C修饰
体外甲基化实验和m5C dot blot检测eIF6对Nsun2活性的影响，并通过AlphaFold2预测和SPR验证结合模式。
评估Nsun2在ILC3中的功能
验证Nsun2对ILC3细胞因子产生和结肠炎的影响
使用RorccreNsun2fl/fl小鼠，检测DSS结肠炎严重性和ILC3细胞因子产生。
探究G3BP1在p38α磷酸化eIF6中的作用
确定p38α磷酸化eIF6的辅助因子
通过免疫沉淀和质谱鉴定eIF6相互作用蛋白，发现G3BP1并通过体外激酶实验验证其促进p38α磷酸化eIF6。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| GlutaMAX | -- | -- | |
| 白介素-7 | -- | -- | |
| 白介素-15 | -- | -- | |
| 视黄酸 | -- | 302-79-4 | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | |
| 细胞处理 | 白介素-1β | -- | -- |
| 白介素-23 | -- | -- | |
| 布雷菲德菌素A | MCE | HY-16592 | |
| 表没食子儿茶素没食子酸酯 | -- | -- | |
| 动物实验 | 葡聚糖硫酸钠 | MP | 0216011080 |
| 蛋白表达与纯化 | 异丙基硫代半乳糖苷 | -- | 367-93-1 |
| GST柱 | Cytiva | -- | |
| TEV蛋白酶 | -- | -- | |
| Superdex 200 16/20层析柱 | GE | -- | |
| Q阴离子交换柱 | GE | -- | |
| 激酶实验 | MKK6EE | SinoBiological | 10422-H20B1-20 |
| 三磷酸腺苷 | -- | 56-65-5 | |
| 激酶缓冲液 | CST | 9802 | |
| Phos-tag SDS-PAGE凝胶电泳 | WAKO | 198-17981 | |
| RNA甲基化实验 | S-腺苷甲硫氨酸 | -- | 29908-03-0 |
| Monarch RNA纯化试剂盒 | NEB | T2030L | |
| 核苷消化混合液 | NEB | M0649S | |
| 抗m5C抗体 | CST | 28692S | |
| 过氧化物酶标记山羊抗兔IgG (H+L) | Beyotime | A0208 | |
| 亚甲基蓝 | Solarbio | G1300 | |
| 生物物理分析 | Biacore 8k+表面等离子共振仪 | Cytiva | -- |
| CM5传感芯片 | Cytiva | -- | |
| Biacore Insight Evaluation软件 | Cytiva | -- | |
| 流式细胞术 | Fortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| FlowJo软件V10 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | Zeiss LSM880共聚焦显微镜（带Airyscan） | Zeiss | -- |
| Zeiss LSM 980共聚焦显微镜（带Airyscan 2） | Zeiss | -- | |
| Fluoromount G封片剂 | Thermo Fisher Scientific | 00-4958-02 | |
| OCT包埋剂 | Sakura | 4583 | |
| CM3050 S冰冻切片机 | Leica | -- | |
| 免疫沉淀 | 蛋白A/G磁珠 | MCE | HY-K0202 |
| qPCR | StepOnePlus实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- |
| Hieff qPCR SYBR Green预混液 | Yeasen | 11203ES08 | |
| RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Trizol试剂 | -- | -- | |
| smFISH | Stellaris RNA FISH探针 | XianghongBio | -- |
| µ-Slide 8孔高腔室玻片 | ibidi | 80806 | |
| 免疫沉淀 | 抗eIF6抗体 | Santa Cruz | sc-390432 |
| 抗磷酸化p38抗体 | CST | 4511 | |
| 免疫荧光 | 抗CD45抗体 | BioLegend | 103128 |
| 抗EpCAM抗体 | BioLegend | 400532 | |
| 抗磷酸化p38抗体 | CST | 4511S | |
| 抗GFP抗体 | BioLegend | 338007 | |
| 抗Nsun2抗体 | Proteintech | 20854-1-AP | |
| 流式细胞术 | Fixable Viability Dye eFluor 780活细胞染料 | eBioscience | 65-0865-14 |
| 抗CD45抗体（克隆30-F11） | BioLegend | 103128 | |
| 抗CD3抗体（克隆145-2C11） | BioLegend | 100320 | |
| 抗CD90.2抗体（克隆30-H12） | BioLegend | 105335 | |
| 抗CD4抗体（克隆GK1.5） | eBioscience | 63-0041-82 | |
| 抗TCRβ抗体（克隆H57-597） | BioLegend | 109206 | |
| 抗IL-17A抗体（克隆eBio17B7） | eBioscience | 17-7177-81 | |
| 抗IL-22抗体（克隆IL22JOP） | eBioscience | 46-7222-82 | |
| 抗IFNγ抗体（克隆XMG1.2） | eBioscience | 48-7311-82 | |
| 抗GM-CSF抗体（克隆BVD2-21C11） | BD | 554406 | |
| 免疫荧光 | 抗Foxp3抗体（克隆FjK-16s） | Invitrogen | 17-5773-82 |
| 抗RORγt抗体（克隆B2D） | eBioscience | 25-6981-80 | |
| 抗GATA-3抗体（克隆TWAJ） | Thermo Fisher Scientific | 50-9966-42 | |
| 抗m5C抗体（克隆D3S2Z） | CST | 28692S | |
| 免疫沉淀 | 抗eIF6抗体（克隆A-2） | Santa Cruz | sc-390432 |
| 抗磷酸化p38抗体（克隆D3F9） | CST | 4511S | |
| 蛋白A/G磁珠 | MCE | HY-K0202 | |
| 蛋白质印迹 | 微管蛋白抗体 | -- | -- |
| HSP90抗体 | -- | -- | |
| 辣根过氧化物酶标记二抗 | -- | -- | |
| ECL底物 | Millipore | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| DSS诱导结肠炎模型 | 小鼠品系、月龄、DSS浓度和处理时间 阅读提示：Materials and methods - DSS-induced acute colitis |
| ILC3分离与刺激 | 组织消化方法、细胞因子刺激浓度和时间 阅读提示：Materials and methods - Isolation of colonic lymphocytes |
| mRNA核质分离 | 细胞裂解、离心条件、RNA提取和qPCR引物 阅读提示：Materials and methods - Quantitative real-time PCR |
| 蛋白相互作用分析 | Co-IP抗体、裂解缓冲液、洗涤条件 阅读提示：Materials and methods - Immunoprecipitation |
| 体外甲基化实验 | Nsun2、eIF6、SAM浓度、反应时间和温度 阅读提示：Materials and methods - In vitro Nsun2-mediated m5C modification assay |