鉴定隐秘lncRNA编码的ORF并筛选依赖性
系统鉴定在ER+ BC中活跃翻译的隐秘lncRNA编码ORF，并确定其功能重要性
对MCF7细胞进行Ribo-seq预测ORF，构建sgRNA文库进行CRISPR/Cas9敲除筛选，结合TCGA分析，鉴定出28个候选ORF。
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CRISPR/Cas9筛选揭示人类癌症中隐秘lncRNA编码开放阅读框的功能性翻译
CRISPR/Cas9 screen uncovers functional translation of cryptic lncRNA-encoded open reading frames in human cancer
实验完整度
高整合了核糖体谱、CRISPR/Cas9筛选、RNA-seq、ChIP-seq、蛋白质组学和功能实验（包括体外和体内模型）等多层次证据。
主要模型
MCF7细胞系 T47D细胞系 ZR75-1细胞系 异种移植小鼠模型
重点核对
CRISPR/Cas9筛选使用3,913个sgRNA，在MCF7细胞中，21天筛选。 LINC00992和GATA3-AS1的ORF敲除抑制MCF7和T47D细胞生长。 GT3-INCP与GATA3相互作用，且Del-M8突变体破坏该相互作用。 GT3-INCP敲除或GATA3敲低导致雌激素反应基因和E2F1靶标显著下调。 体内实验使用ZR75-1细胞原位移植，每组6只小鼠，并植入E2颗粒。
摘要
新兴证据表明，长链非编码RNA（lncRNA）内的隐秘翻译可能产生具有重要发育/生理功能的新型蛋白质。然而，这种隐秘翻译在复杂疾病（如癌症）中的作用仍然难以捉摸。在这里，我们应用了一种整合策略，结合核糖体谱分析和CRISPR/Cas9筛选，以及乳腺癌（BC）的大规模分子/临床数据分析，确定了雌激素受体α阳性（ER+）BC对管腔肿瘤中上调的lncRNA基因所编码的隐秘ORF的依赖性。我们证实了由LINC00992编码的未注释蛋白GATA3相互作用隐秘蛋白（GT3-INCP）的体内促肿瘤功能，其表达与管腔肿瘤的不良预后相关。GT3-INCP被雌激素/ER上调，并调节雌激素依赖性细胞生长。机制上，GT3-INCP与GATA3（一种对乳腺发育/BC细胞增殖至关重要的主转录因子）相互作用，并共同调控涉及许多BC易感/风险基因并影响雌激素反应/细胞增殖的基因表达程序。GT3-INCP/GATA3结合共同的顺式调控元件，并上调促肿瘤和雌激素调节的BC易感/风险基因MYB和PDZK1的表达。我们的研究表明，隐秘lncRNA编码蛋白可以成为驱动癌症异常转录的主转录调控网络的重要整合组件，并提示“隐藏的”lncRNA编码蛋白质组可能是治疗靶点发现的新空间。关键词：遗传学，肿瘤学关键词：乳腺癌，非编码RNA，翻译
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 隐秘lncRNA编码蛋白在复杂疾病（如癌症）中的功能和机制是什么？
- 核心机制
- GT3-INCP与GATA3相互作用并共同调控基因表达程序，其中包含许多BC易感/风险基因，并影响雌激素反应和细胞增殖。
- 主要证据
- 通过crispr筛选、RNA-seq、ChIP-seq和蛋白质组学等实验证据，证明了GT3-INCP与GATA3相互作用并共同调控MYB和PDZK1的表达。
- 研究意义
- 隐秘lncRNA编码蛋白是主转录调控网络的重要组成部分，可能为治疗靶点发现提供新的方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证候选ORF的功能
验证候选ORF（LINC00992和GATA3-AS1）对细胞增殖和克隆形成的影响
通过sgRNA介导的敲除和siRNA敲低实验，检测对MCF7和T47D细胞生长和克隆形成的影响，并进行回补实验。
鉴定GT3-INCP蛋白的存在和特性
证实LINC00992编码一个新蛋白GT3-INCP，并分析其亚细胞定位
使用RACE确定LINC00992转录本全长，定制抗体检测外源和內源GT3-INCP，质谱确认肽段，免疫荧光和亚细胞分级实验显示其定位。
研究GT3-INCP的体内和体外功能
验证GT3-INCP在体内和体外的肿瘤促进作用
过表达或敲低GT3-INCP，检测细胞增殖和克隆形成；异种移植模型验证体内肿瘤生长。
揭示GT3-INCP的相互作用蛋白和机制
识别与GT3-INCP相互作用的蛋白，并确定参与其功能的区域
使用AP-MS鉴定相互作用蛋白，其中包含GATA3，并通过co-IP验证；构建突变体并做回补实验确定关键区域。
分析GT3-INCP和GATA3的共同靶基因
确定GT3-INCP和GATA3共同调控的基因及其功能
进行RNA-seq（敲除或敲低），GSEA分析，GO分析，ChIP-seq确定结合位点，整合分析确定共同靶基因。
验证GT3-INCP和GATA3对共同靶基因的调控
验证GT3-INCP和GATA3共同靶基因（如MYB和PDZK1）的表达调控
通过qRT-PCR和ChIP-qPCR验证MYB和PDZK1的表达及GT3-INCP/GATA3在它们启动子上的结合，并研究GT3-INCP对GATA3结合的影响。
研究雌激素对GT3-INCP的调控及其作用
研究雌激素/ER对GT3-INCP表达的调控，并确定其在雌激素依赖性生长中的作用
检测E2处理后GT3-INCP的表达变化，敲低ER或使用4-OHT抑制ER观察效果，并探究GT3-INCP对E2依赖性生长的作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
预测和筛选隐秘ORF
体内实验
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Hyclone | SH30027.1 |
| DMEM培养基 | Hyclone | SH30022.01 | |
| DMEM/F12培养基 | Invitrogen | 11330-032 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10437-028 | |
| 青霉素/链霉素 | Corning | 30-002-CI | |
| 马血清 | Invitrogen | 16050-122 | |
| 表皮生长因子 | STEMCELL | 78006.1 | |
| 氢化可的松 | STEMCELL | 74142 | |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | I3536 | |
| 培养箱 | Thermo Fisher Scientific | HEARCELL VIOS 160i | |
| pLenti-CMV-Blast DEST载体 | Addgene | 17452 | |
| 分子克隆 | Twist Bioscience基因合成 | Twist Bioscience | -- |
| Western blot | 抗FLAG M2亲和凝胶 | Sigma-Aldrich | A2220 |
| 抗GATA3抗体 | CST | 5852 | |
| 抗HA标签抗体 | Proteintech | 51064-2-AP | |
| 抗β-肌动蛋白单克隆抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| 抗β-微管蛋白多克隆抗体 | Proteintech | 10068-1-AP | |
| 抗雌激素受体多克隆抗体 | Proteintech | 21244-1-AP | |
| 定制抗GT3-INCP抗体 | ABclonal | -- | |
| ChIP | 抗GATA3抗体 | Abcam | ab199428 |
| RNA提取 | RNeasy Mini试剂盒 | QIAGEN | 74104 |
| cDNA合成 | iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | 1708890 |
| qRT-PCR | 2×通用SYBR Green快速qPCR预混液 | ABclonal | RK21203 |
| CFX96 Touch实时荧光定量PCR检测系统 | Bio-Rad | -- | |
| 蛋白质印迹和质谱 | NuPAGE 10% Bis-Tris凝胶 | Life Technologies | -- |
| 质谱 | 纳升液相色谱1200系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Orbitrap Fusion Lumos ETD质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Proteome Discoverer 1.4软件 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Mascot 2.4软件 | Matrix Science | -- | |
| 蛋白质相互作用 | Pierce IP裂解缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | 87787 |
| 3×FLAG肽 | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| SDS-PAGE样品缓冲液 | Bio-Rad | 1610747 | |
| 慢病毒包装 | pCMV-VSV-G包装质粒 | -- | -- |
| psPAX2包装质粒 | -- | -- | |
| lentiCRISPR v2载体 | Addgene | 52961 | |
| 转染 | jetPRIME转染试剂 | Polyplus Transfection | 114-15 |
| Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 13778150 | |
| 慢病毒感染 | 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | TR-1003 |
| 雌激素处理 | 无酚红RPMI-1640培养基 | Gibco | 11835-030 |
| 活性炭剥离胎牛血清 | Gibco | 12676-029 | |
| β-雌二醇 | Sigma-Aldrich | E2758 | |
| 4-羟基他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | SML1666 | |
| 细胞增殖检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04-13 |
| 酶标仪 | BioTek | Synergy H1 | |
| 免疫印迹成像 | ChemiDoc Touch成像系统 | Bio-Rad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRISPR/Cas9敲除筛选 | 筛查细胞系（MCF7）、sgRNA文库（包含3913个靶向ORF）、筛选时间（21天）、阳性对照sgRNA。 阅读提示：见Methods中“CRISPR/Cas9敲除”部分及Supplemental Methods |
| 细胞培养 | 细胞系来源（ATCC）、培养基（RPMI-1640或DMEM）、血清（10% FBS）等。 阅读提示：见Methods中“Cell lines, plasmids, and antibodies”部分 |
| 雌激素处理 | 细胞饥饿处理（去除雌激素3天）、E2浓度（30 nM）、处理时间（6-24小时）。 阅读提示：见Methods中“Cell growth and gene expression analysis with estrogen treatment”部分 |
| 细胞增殖和克隆形成分析 | 细胞接种密度（1000-1500个/孔）、CCK-8检测时间点（4天）、克隆形成周期（2周）。 阅读提示：见Methods中“Cell growth and colony formation assay”部分 |
| 体内异种移植实验 | 小鼠品系（无胸腺裸鼠）、年龄（7周）、每组数量（6只）、细胞数量（4×10^6细胞）、E2颗粒植入、监测频率和持续时间（9周）。 阅读提示：见Methods中“Orthotopic xenograft experiments”部分 |