验证TREM1缺失的抗肿瘤作用
确定TREM1在肿瘤生长中的作用
在Trem1+/+和Trem1–/–小鼠中接种B16F10和MCA205肿瘤，或对Trem1+/+小鼠用VJDT处理，测量肿瘤生长
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靶向TREM1通过抑制髓源性抑制细胞并遏制抗PD-1耐药性增强抗肿瘤T细胞免疫
Targeting TREM1 augments antitumor T cell immunity by inhibiting myeloid-derived suppressor cells and restraining anti-PD-1 resistance
实验完整度
高包括基因敲除小鼠和药物抑制剂模型，scRNA-Seq和流式细胞术验证，功能抑制实验，PDX模型，以及患者样本分析
主要模型
B16F10黑色素瘤小鼠模型 MCA205纤维肉瘤小鼠模型 HepG2细胞系及其异种移植模型 患者来源黑色素瘤异种移植模型
重点核对
Trem1基因敲除或VJDT处理对肿瘤生长的影响 TME中MDSC（特别是M-MDSC）频率和免疫抑制功能的变化 CD8+ T细胞活化、细胞毒性和耗竭状态变化 抗PD-1与VJDT联用的协同抗肿瘤效果 VJDT对患者来源黑色素瘤异种移植肿瘤中信号通路的影响
摘要
髓样细胞表达的触发受体1（TREM1）在慢性炎症性疾病和与大多数实体瘤相关的炎症性肿瘤微环境（TME）的发展中起关键作用。我们研究了TREM1信号缺失是否能消除免疫抑制性TME并增强癌症免疫。为了探究TREM1在癌症中的治疗潜力，我们使用了Trem1缺陷小鼠并开发了一种新型小分子TREM1抑制剂VJDT。我们证明，基因或药理学TREM1沉默显著延迟了小鼠黑色素瘤（B16F10）和纤维肉瘤（MCA205）模型中的肿瘤生长。单细胞RNA测序结合TREM1缺陷期间的功能分析显示，髓源性抑制细胞（MDSCs）的免疫抑制能力降低，同时细胞毒性CD8+ T细胞扩增且PD-1表达增加。此外，TREM1抑制增强抗PD-1治疗抗肿瘤作用，部分是通过限制MDSC频率和消除T细胞耗竭。在患者来源的黑色素瘤异种移植肿瘤中，VJDT治疗下调了参与细胞增殖、迁移和存活的关键致癌信号通路。我们的工作强调了TREM1在癌症进展中的作用，既在癌细胞中内在表达，也在TME中外在表达。因此，靶向TREM1以修饰免疫抑制性TME并提高免疫检查点治疗疗效，代表了我们认为有前景的癌症治疗方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TREM1信号在肿瘤免疫逃逸中的作用及其作为治疗靶点的潜力
- 核心机制
- TREM1通过促进MDSC的积累和免疫抑制功能，以及可能通过癌细胞内在的致癌信号通路，塑造免疫抑制性TME，从而抑制抗肿瘤免疫并导致抗PD-1耐受
- 主要证据
- Trem1敲除或VJDT处理可减小肿瘤体积，scRNA-Seq和流式细胞术显示MDSC减少、CD8+ T细胞功能改善，与抗PD-1联用效果增强；PDX模型中VJDT下调增殖相关通路
- 研究意义
- 靶向TREM1可能是一种有前景的癌症治疗策略，可改善免疫抑制性TME并提高免疫检查点治疗的疗效
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
流式细胞术分析肿瘤浸润免疫细胞
评估TREM1缺失对抗肿瘤免疫细胞组成的影响
从肿瘤组织中分离免疫细胞，用流式细胞术分析TAMs、MDSCs、CD8+/CD4+ T细胞亚群及其标志物
单细胞RNA测序分析肿瘤微环境
全面解析TREM1缺失对肿瘤浸润免疫细胞转录组的影响
对CD45+或CD45+CD11b+肿瘤浸润细胞进行scRNA-Seq，分析细胞亚群、基因表达和信号通路变化
MDSC功能抑制实验和ROS检测
评估TREM1缺失对MDSC免疫抑制功能的影响
从Trem1+/+和Trem1–/–小鼠肿瘤中分离MDSC，与CFSE标记的CD3+ T细胞共培养，测量T细胞增殖；检测MDSC的ROS产生
TREM1抑制剂与抗PD-1联合治疗
评估TREM1抑制与抗PD-1联合治疗是否增强抗肿瘤效果
对B16F10荷瘤Trem1+/+小鼠分别给予VJDT、抗PD-1或联合治疗，测量肿瘤生长，分析肿瘤浸润免疫细胞
体外细胞实验验证TREM1抑制功能
评估TREM1敲低或抑制对癌细胞增殖和迁移的影响
在HepG2细胞中通过shRNA敲低TREM1，或使用VJDT处理，进行增殖和细胞周期分析；对HepG2和B16F10细胞进行迁移实验
异种移植模型评估TREM1抑制效果
在体内评估TREM1敲低或VJDT治疗对肿瘤生长的影响
将TREM1敲低的HepG2细胞或shControl接种于NSG小鼠，或对携带PDX的NSG小鼠用VJDT处理，测量肿瘤生长，分析基因表达
TCGA数据库分析及患者样本验证
评估TREM1表达与人类癌症预后及免疫浸润的关系
利用TCGA和GTEx数据分析TREM1表达水平，Kaplan-Meier生存分析，相关性分析；采用多重免疫荧光染色验证TREM1蛋白在肿瘤组织中的表达
信号通路分析和GSEA
确定TREM1抑制影响的关键信号通路
对微阵列数据或scRNA-Seq数据进行通路富集分析（如Wikipathway, GSEA）
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 肿瘤模型建立 | B16F10 | -- | -- |
| MCA205 | -- | -- | |
| HepG2 | -- | -- | |
| 药物处理 | VJDT | -- | -- |
| 抗PD-1抗体 | BioXCell | BE0273 | |
| IgG2a同型对照 | BioXCell | BE0089 | |
| 肿瘤组织消化 | gentleMACS Octo Dissociator带加热器 | Miltenyi Biotech | -- |
| 肿瘤解离试剂盒 | Miltenyi Biotech | -- | |
| 流式细胞术 | TruStain FcX | BioLegend | 101319 |
| 抗F4/80-APC抗体 | BioLegend | 123116 | |
| 抗F4/80-FITC抗体 | BioLegend | 123108 | |
| 抗CD11b-APC抗体 | BioLegend | 101212 | |
| 抗CD11b-PE抗体 | BioLegend | 101208 | |
| 抗CD11b-APC/Cy7抗体 | BioLegend | 101226 | |
| 抗Gr1-APC/Cy7抗体 | BioLegend | 108423 | |
| 抗Ly6C-PE抗体 | BioLegend | 128007 | |
| 抗Ly6C-APC/Cy7抗体 | BioLegend | 128026 | |
| 抗Ly6G-PE抗体 | BioLegend | 127608 | |
| 抗Ly6G-APC/Cy7抗体 | BioLegend | 127624 | |
| 抗CD3-FITC抗体 | BioLegend | 100204 | |
| 抗CD8-PerCP抗体 | BioLegend | 140417 | |
| 抗CD25-APC/Cy7抗体 | BioLegend | 101918 | |
| Cyto-Fast固定/通透缓冲液 | BioLegend | 426803 | |
| 抗TNFα-PE抗体 | eBioscience | 12-7321-81 | |
| 抗TGF-β1-PE抗体 | BioLegend | 141403 | |
| 抗IFN-γ-PE抗体 | BioLegend | 113603 | |
| 抗IL-2-PE抗体 | eBioscience | 12-7021-81 | |
| 抗IL-10-PE抗体 | BioLegend | 3505007 | |
| 抗IL-17-PE抗体 | BioLegend | 506903 | |
| 抗IL-1b-PE抗体 | eBioscience | 12-7114-80 | |
| 抗颗粒酶B-FITC抗体 | BioLegend | 506903 | |
| Attune NxT声波聚焦流式细胞平台 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| FlowJo v10.0 | -- | -- | |
| scRNA-Seq | CD45磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-110-618 |
| CD11b磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-049-601 | |
| 死细胞去除试剂盒 | STEMCELL | -- | |
| Chromium控制器 | 10x Genomics | -- | |
| Chromium Next GEM单细胞3'试剂盒v3.1 | 10x Genomics | -- | |
| NextSeq 500测序仪 | Illumina | -- | |
| Mid Output v2.5（150循环）试剂盒 | Illumina | -- | |
| T细胞抑制实验 | MDSC分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- |
| Pan T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- | |
| CFSE | Thermo Fisher Scientific | C34570 | |
| RPMI培养基 | STEMCELL Technologies | -- | |
| 胎牛血清 | Hyclone | -- | |
| 青霉素 | Corning | -- | |
| 链霉素 | Corning | -- | |
| 抗CD3/CD28磁珠 | Gibco | 11-452-D | |
| ROS检测 | 活性氧检测试剂盒 | Invitrogen | -- |
| PMA | Thermo Fisher Scientific | 50-058-20001 | |
| 慢病毒转染 | 人pLKO.1慢病毒人TREM1 shRNA靶基因集 | Horizon Discovery | RHS4533-EG54210 |
| terrific broth培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| QIAprep Spin质粒小提试剂盒 | Qiagen | -- | |
| Trans-Lentiviral shRNA包装试剂盒 | Perkin Elmer | -- | |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | -- |
| 基因表达分析 | Clariom S微阵列 | -- | -- |
| 转录组分析控制台v4.0 | Applied Biosystems | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 肿瘤模型和处理 | Trem1+/+和Trem1–/–小鼠（C57BL/6J背景），8周龄；接种细胞数和类型（B16F10 1x10^5，MCA205 1x10^6）；VJDT剂量（20 mg/kg）和给药方案（腹腔注射，第8天开始隔天至第20天）；抗PD-1剂量（200 μg）和同型对照（IgG2a）；实验终点（第22天） 阅读提示：Methods: Tumor models and treatments; Figure 1B; Figure 5A |
| 流式细胞术分析 | 肿瘤浸润免疫细胞群的标志物组合（TAM、MDSC、M-MDSC、PMN-MDSC、CD8+ T细胞亚群）；抗体克隆、荧光标记和稀释度（如F4/80、CD11b、Gr-1、Ly6C、Ly6G、CD8、CD25、PD-1等）；固定/破膜缓冲液（Cyto-Fast Fix/Perm）；流式仪器和软件（Attune NxT, FlowJo v10.0） 阅读提示：Methods: Flow cytometry analysis of MDSCs和T cells; Figure 1C-J; Figure 2C-D; Figure 5C-H |
| 单细胞RNA测序 | 细胞分选策略（CD45+或CD45+CD11b+）；每个样本的目标细胞数（5,000或4,200）；10x Genomics协议版本（Chromium Next GEM Single Cell 3' v3.1）；测序平台（NextSeq 500）；数据预处理和注释方法（Cell Ranger v5.0.1, Loupe Browser v6.0, Partek Flow, ImmGen数据库） 阅读提示：Methods: scRNA-Seq sample preparation和scRNA-Seq data processing; Figure 2A-B; Figure 3A-E; Figure 4A-C; Figure 6A-F; Figure 7A-D |
| MDSC功能实验 | MDSC纯度（>80%-90%）；T细胞分离和标记（CFSE，2 μM）；共培养比例（2:1）和刺激条件（anti-CD3/CD28 beads）；ROS检测方法（ROS assay kit，PMA 30 ng/mL） 阅读提示：Methods: T cell suppression assay和ROS detection; Figure 4D-E |
| 细胞系实验 | HepG2细胞；TREM1敲低克隆（shTREM1 #52, #53, #54）和对照（shControl）；VJDT处理浓度（50 μM和10 μM）；增殖检测（WST-1 assay）；细胞周期分析（24小时） 阅读提示：Methods: Lentiviral TREM1 knockdown; Figure 8A-C; Supplemental Figure 5 |
| 异种移植模型 | NSG小鼠（6-8周龄）；HepG2细胞系（1×10^6）皮下注射；PDX模型（TM00943）购买于Jackson Laboratory；VJDT剂量（20 mg/kg）及给药时间（PDX从第30至48天）；对照组（DMSO）；肿瘤体积测量频率 阅读提示：Methods: Tumor models and treatments; Figure 8D; Figure 10A |