UPFL基因工程小鼠模型的建立与验证
模拟FGFR3突变与TP53突变共存的膀胱癌，并验证其组织学和分子特征是否与人肿瘤相似。
将人FGFR3 S249C cDNA敲入Col1a1基因座，与Trp53R270H和Upk3a-CreERT2小鼠杂交，通过他莫昔芬诱导Cre重组酶表达，使小鼠产生膀胱肿瘤。通过超声监测肿瘤形成，并取材进行组织学检查和RNA测序。
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FGFR抑制通过消除免疫抑制增强FGFR3突变小鼠膀胱癌的抗PD-1疗效
FGFR inhibition augments anti-PD-1 efficacy in murine FGFR3-mutant bladder cancer by abrogating immunosuppression
实验完整度
高包含基因工程小鼠模型、同种异体移植瘤模型、体外细胞实验、体内治疗实验、单细胞转录组测序及流式细胞术等多个独立证据层级，并明确进行了功能与机制验证。
主要模型
UPFL小鼠模型（FGFR3S249C和Trp53R270H突变） UPFL1同种异体移植瘤模型 UPFL1和UPFL3细胞系 FoxP3+GFP+小鼠脾脏来源的Tregs
重点核对
UPFL小鼠使用他莫昔芬（5 mg/只，隔日一次，共3次，口服管饲）诱导Cre介导的基因重组 同种异体移植瘤模型中，UPFL1细胞皮下注射5×10^6个细胞，治疗在肿瘤体积150-300 mm3时开始 厄达替尼给药剂量为12.5 mg/kg，口服管饲，每日两次，周一至周五 抗PD-1（克隆29F.1A12）或同型对照IgG2a（克隆2A3）每周三次（周一、周三、周五）腹腔注射 流式细胞术检测免疫细胞亚群，包括Treg（CD4+FoxP3+）比例
摘要
靶向治疗与免疫检查点抑制（ICI）的结合是研究热点。我们研究了成纤维细胞生长因子受体（FGFR）抑制与ICI在膀胱尿路上皮癌（UC）中的相互作用，其中FGFR3在50%的病例中发生改变。使用FGFR3驱动的、Trp53突变的小鼠基因工程模型（UPFL），我们证明UPFL肿瘤重现了其FGFR3改变的人类对应物的组织学和分子亚型。此外，UPFL1同种异体移植物对ICI表现出超进展，并与调节性T细胞（Tregs）的扩增相关。厄达替尼在体外阻断Treg增殖，而体内ICI诱导的Treg扩增被FGFR抑制完全消除。厄达替尼与ICI联合治疗产生了较高的治疗效果。总的来说，我们的工作证实，在小鼠中，FGFR3和Trp53的共同改变导致高级别非肌层浸润性UC，并揭示了FGFR抑制在阻断ICI诱导的Treg扩增中先前未被充分认识的作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- FGFR3突变是否影响膀胱肿瘤的分子亚型和肿瘤微环境，以及FGFR抑制与PD-1阻断联合能否增强抗肿瘤免疫疗效。
- 核心机制
- FGFR抑制（厄达替尼）通过阻断抗PD-1诱导的Treg扩增来消除免疫抑制，从而增强抗PD-1疗效，可能通过FGFR1介导。
- 主要证据
- UPFL1同种异体移植瘤中，厄达替尼与抗PD-1联合治疗显著抑制肿瘤生长，优于单药；流式细胞术显示抗PD-1增加Treg数量，而联合治疗完全消除Treg扩增；体外实验显示厄达替尼剂量依赖性地抑制Treg增殖。
- 研究意义
- 该工作首次提出FGFR抑制可逆转抗PD-1诱导的Treg扩增，为联合治疗FGFR突变膀胱癌提供了临床前依据，并强调了同时抑制FGFR1在联合免疫治疗中的重要性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
UPFL肿瘤的分子分型分析
确定UPFL肿瘤的分子亚型是否与人FGFR3突变相关亚型一致。
对UPFL肿瘤进行批量RNA测序，并与BBN和UPPL肿瘤数据合并，使用共识分子分型和UROMOL分类器进行分型。计算基底和腔面基因特征分数，并进行调控子分析。
厄达替尼处理UPFL肿瘤的单细胞RNA测序
评估FGFR抑制对肿瘤细胞亚群转录组的影响，以确定FGFR3驱动腔面表型是否发生在所有肿瘤细胞中。
肿瘤携带的UPFL小鼠接受厄达替尼或载体处理1周，随后取材进行scRNA-seq。对上皮细胞进行聚类和差异分析，并计算基底和腔面分数。
UPFL1细胞系建立和体外药物敏感性检测
建立可用于同种异体移植的FGFR3突变膀胱癌细胞系，并验证其对厄达替尼的敏感性。
从UPFL小鼠肿瘤中分离细胞，建立UPFL1和UPFL3细胞系。使用CellTiter-Glo检测细胞活力，计算IC50，并用Western blot检测MAPK通路信号。
同种异体移植瘤模型中联合治疗的体内疗效评估
评估厄达替尼与抗PD-1联合治疗对UPFL1肿瘤生长的抑制作用。
C57BL/6小鼠皮下接种UPFL1细胞，肿瘤达到150-300 mm3时开始治疗，分为对照组、厄达替尼组、抗PD-1组和联合组，监测肿瘤体积变化。
肿瘤微环境免疫表型分析
分析不同治疗后肿瘤微环境中的免疫细胞组成，特别是Treg的变化。
对治疗后的肿瘤进行IHC（CD8+Masson's trichrome）和流式细胞术分析，检测CD45+、CD3+、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞和Treg的比例。
体外Treg增殖抑制实验
直接验证厄达替尼对Treg增殖的抑制作用。
从FoxP3-GFP小鼠脾脏中分选Treg，与APCs和抗CD3共培养，加入不同浓度的厄达替尼，通过CellTrace Violet稀释检测增殖。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 基质胶 | Corning | 354234 |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 磷酸盐缓冲液 | Gibco | 10010049 | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | -- |
| 药物处理 | 厄达替尼 | Selleck Chem | S8401 |
| 体内治疗 | 厄达替尼 | Janssen | JNJ-42756493 |
| 抗PD-1抗体 | BioXcell | BE0273 | |
| IgG2a同型对照 | BioXcell | BE0089 | |
| 2-羟丙基-β-环糊精 | MilliporeSigma | 332593 | |
| Western blot | 蛋白测定染料试剂浓缩液 | Bio-Rad | 5000006 |
| FGFR3抗体 | Cell Signaling Technology | 4574 | |
| 磷酸化FGFR抗体 | Cell Signaling Technology | 3471 | |
| Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 9272S | |
| 磷酸化Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| p44/42 MAPK抗体 | Cell Signaling Technology | 9102S | |
| 磷酸化p44/42 MAPK抗体 | Cell Signaling Technology | 9106 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 5125 | |
| 兔IgG HRP偶联二抗 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| 小鼠IgG HRP偶联二抗 | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| RNA测序 | RNeasy试剂盒 | QIAGEN | -- |
| DNA提取 | DNeasy试剂盒 | QIAGEN | -- |
| RNA测序 | TruSeq链式mRNA文库制备试剂盒 | Illumina | 20020595 |
| NextSeq 500测序仪 | Illumina | -- | |
| 实验用细胞 | 小鼠胚胎干细胞（MESC10） | Mirimus | -- |
| 细胞培养 | 胶原酶 | -- | -- |
| 分散酶 | Roche | -- | |
| Georgetown培养基 | -- | -- | |
| Treg增殖实验 | EasySep小鼠T细胞分离试剂盒 | STEMCELL Technologies | -- |
| 抗CD8a生物素 | Invitrogen | 13-0081-82 | |
| MACSQuant Tyto细胞分选仪 | Miltenyi Biotec | -- | |
| CellTrace紫 | Invitrogen | C34571 | |
| 可溶性抗CD3 | eBioscience | 14-0031-85 | |
| 白细胞介素-2 | PeproTech | 212-12 | |
| Zombie NIR可固定活力染料 | BioLegend | 423105 | |
| CD4-PE抗体 | Invitrogen | 12-0042-82 | |
| 流式细胞术 | 脱氧核糖核酸酶I | Sigma-Aldrich | 10104159001 |
| 胶原酶D | Sigma-Aldrich | 11088866001 | |
| Hank平衡盐溶液 | Gibco | 14025-092 | |
| 细胞过滤器 | Thermo Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 红细胞裂解液 | BioLegend | 420301 | |
| Zombie Aqua可固定活力试剂盒 | BioLegend | 423101/423102 | |
| BD Fortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| FACSDiva软件 | BD Biosciences | v.9.0 | |
| FlowJo软件 | FlowJo LLC | v.10.8.0 | |
| 免疫组织化学 | Ki-67抗体 | Cell Signaling Technology | 12202S |
| 活化的caspase 3抗体 | Biocare Medical | CP229C | |
| Bond脱蜡液 | Leica | AR9222 | |
| Bond洗涤液 | Leica | AR9590 | |
| Bond抗原修复液2 | Leica | AR9640 | |
| Novolink聚合物 | Leica | RE7260-CE | |
| Bond Intense R检测系统 | Leica | DS9263 | |
| Cytoseal 60封片剂 | Thermo Fisher Scientific | 23-244256 | |
| Aperio AT2玻片扫描仪 | Leica | -- | |
| CD8抗体 | Cell Signaling Technology | 98941 | |
| Bond抗原修复液1 | Leica | AR9961 | |
| Masson三色染色试剂盒 | Epredia | 87019 | |
| 免疫组织化学定量 | Aperio图像处理工具箱 | Leica | -- |
| ImageScope软件 | Leica Biosystems | v12.4.3 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| UPFL小鼠模型建立 | 小鼠基因型（Upk3a-CreERT2; Trp53LSL-R270H/+; LSL-FGFR3S249C/+; Rosa26LSL-Luc/+），他莫昔芬给药方案（5 mg，每两天一次，共3次，口服管饲），肿瘤形成监测（超声） 阅读提示：Methods: Mouse strains, Tamoxifen dose and administration and genotyping |
| UPFL肿瘤分子分型 | RNA测序数据分析流程（STAR比对、Salmon定量），共识分型和UROMOL分类方法 阅读提示：Methods: RNA-seq analysis |
| scRNA-seq | 厄达替尼处理时间（1周），样本数量（n=2/组），10× Genomics平台，分析流程（CellRanger、Seurat） 阅读提示：Methods: scRNA-seq analysis, 结果部分Figure 3 |
| 细胞系建立与药物敏感性 | UPFL1/UPFL3细胞系来源，培养基（DMEM），厄达替尼处理时间（96小时），细胞接种数量（500细胞/孔） 阅读提示：Methods: Generation of UPFL1 and UPFL3 cell lines, Cell viability assay |
| 同种异体移植瘤模型治疗 | UPFL1细胞接种数量（5×10^6），治疗起始肿瘤体积（150-300 mm3），厄达替尼剂量（12.5 mg/kg，口服，每日两次，周一至周五），抗PD-1治疗频率（每周三次，腹腔注射） 阅读提示：Methods: Syngeneic tumor formation, Compounds and therapeutic studies |
| 肿瘤微环境免疫分析 | 流式细胞术检测的免疫细胞标记物（CD45、CD3、CD8、CD4、FoxP3、CTLA-4），治疗时间（7天），IHC染色方案（CD8/trichrome） 阅读提示：Methods: Flow cytometry, IHC |
| Treg增殖抑制实验 | Treg分选纯度，APCs照射剂量（30 Gy），厄达替尼浓度（0,1,3 μM），培养时间（3天） 阅读提示：Methods: Treg proliferation assay |