化合物合成与结构-活性关系（SAR）研究
优化HSN748的化学结构，提高其对FLT3突变体的选择性和效力。
合成了一系列HSN748类似物，通过替换哌嗪环、修饰三氟甲基等基团，评估其对FLT3ITD及耐药突变细胞系的抑制活性。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
炔基烟酰胺在耐药急性髓系白血病中显示出抗白血病活性
Alkynyl nicotinamides show antileukemic activity in drug-resistant acute myeloid leukemia
实验完整度
高包含体外细胞系（BaF3、MOLM14）、体内异种移植模型（NSG/NSGS小鼠）、遗传小鼠模型（Tet2–/–:Flt3ITD）以及患者来源异种移植（PDX）等多个独立证据层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
BaF3细胞表达FLT3ITD及耐药突变 MOLM14和MV411细胞系 Tet2–/–:Flt3ITD/ITD遗传小鼠模型 AML患者来源异种移植（PDX）模型 NSG和NSGS小鼠移植模型
重点核对
HSN748和HSN608对FLT3ITD的IC50值（HSN748为0.04 nM，HSN608为0.09 nM） HSN748对FLT3ITD–F691L和FLT3ITD–D835Y突变细胞的IC50值（分别为1.52 nM和6.62 nM） HSN748在BaF3细胞中的靶点停留时间（385分钟） 体内实验中HSN748的给药剂量（20 mg/kg，口服，每周5次） PDX实验中使用NSGS小鼠，移植后1周随机分组，治疗4周
摘要
FLT3的激活突变导致急性髓系白血病（AML）患者中造血干细胞和祖细胞（HSC/Ps）的生长和存活失调，导致总生存期差。接受靶向突变FLT3的研究药物（包括Quizartinib和Crenolanib）治疗的AML患者会产生耐药性。耐药性的产生主要由于共发生突变的获得、额外存活通路的激活以及额外FLT3突变的发生。尽管FLT3突变在AML中的高患病率及其临床重要性，但可用的靶向治疗选择仍然很少。我们确定了2种新型烟酰胺类FLT3抑制剂（HSN608和HSN748），它们以亚纳摩尔浓度靶向FLT3突变，并对耐药性FLT3继发突变有效。这些化合物在耐药性AML、复发/难治性AML以及携带TET2表观遗传突变与FLT3ITD组合的AML中显示出抗白血病活性。我们证明，在体内，HSN748在抑制FLT3ITD方面优于FDA批准的FLT3抑制剂Gilteritinib。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 开发新型FLT3抑制剂，以克服AML中对现有FLT3抑制剂的耐药性。
- 核心机制
- HSN748是一种II型FLT3抑制剂，通过占据DFG-out构象，抑制FLT3及其耐药突变体的激酶活性，从而阻断下游PI3K/AKT/mTOR和RAS/MAPK通路，诱导白血病细胞分化和凋亡。
- 主要证据
- 体外实验显示HSN748和HSN608对FLT3ITD及耐药突变细胞系（BaF3、MOLM14）具有亚纳摩尔级抑制活性；体内实验中，在MOLM14异种移植模型、Tet2–/–:Flt3ITD/ITD遗传小鼠模型以及多个PDX模型中，HSN748均显示出优于Gilteritinib的疗效。
- 研究意义
- HSN748可能为FLT3突变的复发/难治性AML患者提供新的治疗选择。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外激酶结合和选择性分析
确定HSN748对FLT3及其突变体的结合亲和力，以及其对激酶组的选择性。
使用KINOMEScan平台对超过450种激酶进行结合分析，并计算HSN748对FLT3突变体的解离常数（Kd）。
分子对接和分子动力学模拟
预测HSN748与FLT3的结合模式，并评估其结合稳定性。
使用CANDOCK软件将HSN748与FLT3（PDB ID: 4XUF）进行对接，并进行100 ns的分子动力学模拟，分析配体与DFG基序的距离和RMSD。
体外细胞增殖抑制和信号通路分析
评估HSN608和HSN748对FLT3突变细胞增殖的抑制作用，并验证其对FLT3信号通路的抑制。
用不同浓度的抑制剂处理表达FLT3ITD、FLT3ITD–F691L、FLT3ITD–D835Y的BaF3细胞以及MOLM14、MV411细胞，测定细胞活力，并通过Western blot检测FLT3、STAT5、ERK的磷酸化水平。
体内药效和靶点抑制评估
评估HSN748在异种移植模型中的抗白血病效果，并验证其体内靶点抑制。
将MOLM14或MOLM14-F691L细胞植入NSG小鼠，给予HSN748或Gilteritinib治疗，监测肿瘤生长和生存期。通过药代动力学和药效动力学分析评估药物暴露和FLT3信号抑制。
蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析
全局评估HSN748对MOLM14细胞蛋白质表达和磷酸化状态的影响。
用100 nM HSN748处理MOLM14细胞2小时和24小时，进行基于质谱的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析。
转录组学分析（RNA-Seq）
评估HSN748对MOLM14细胞基因表达的影响。
用2 nM HSN748处理MOLM14细胞24小时，提取RNA进行RNA-Seq分析，鉴定差异表达基因。
遗传小鼠模型中的疗效评估
在携带Tet2–/–和Flt3ITD/ITD突变的小鼠模型中验证HSN748的抗白血病活性。
将Tet2–/–:Flt3ITD/ITD小鼠的骨髓单个核细胞与野生型细胞混合移植入致死辐照的F1受体小鼠，6周后开始口服HSN748治疗（20 mg/kg，每周5次，共6周），分析外周血、脾脏和骨髓的细胞变化。
患者来源异种移植（PDX）模型中的疗效评估
在PDX模型中比较HSN748与Gilteritinib的抗白血病效果。
将多种突变组合的AML患者细胞移植入NSGS小鼠，1周后随机分组，给予HSN748或Gilteritinib治疗（20 mg/kg，口服，每周5天，共4周），监测外周血、脾脏和骨髓中人类CD45阳性细胞的比例，并评估生存期。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 细胞活力测定 | WST-1试剂 | Clontech / Roche Diagnostics | 11644807001 |
| Western blot | pFLT3抗体 | Cell Signaling Technology | 3461 |
| pSTAT5抗体 | Cell Signaling Technology | 9359 | |
| pERK抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| ERK1/2抗体 | Santa Cruz | sc514302 | |
| FLT3抗体 | Cell Signaling Technology | 3462 | |
| GAPDH-HRP抗体 | Cell Signaling Technology | 884 | |
| 分子动力学模拟 | CANDOCK | -- | -- |
| 基因表达分析 | Trizol试剂 | -- | -- |
| 体内实验 | 甲基纤维素 | -- | -- |
| 柠檬酸盐缓冲液 | -- | -- | |
| NSG小鼠 | -- | -- | |
| NSGS小鼠 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞活力测定 | 细胞密度（5×10^3细胞/孔）、药物处理时长（72小时）、WST-1孵育时间（4小时） 阅读提示：Methods：Cell culture and in vitro drug studies |
| Western blot | 细胞处理时长（1小时）、抗体稀释比例未明确、蛋白上样量未明确 阅读提示：Methods：Western blotting |
| 体内药效实验 | 细胞接种数量（5×10^5）、动物品系（NRG）、给药剂量（未明确，参照图例）、给药途径（口服）、给药频率（每天1次，每周5天） 阅读提示：Methods：In vivo drug studies 和 Figure 3 图例 |
| 药代动力学 | 给药剂量（未明确）、给药途径（静脉和口服）、采血时间点、LC/MS分析方法 阅读提示：Methods：In vivo drug studies |
| 蛋白质组学实验 | 细胞处理浓度（100 nM）、处理时间（2小时和24小时）、生物学重复次数（3次） 阅读提示：Methods：Drug treatment for proteomics experiment |
| RNA-Seq实验 | 细胞处理浓度（2 nM）、处理时间（24小时）、生物学重复次数（3次） 阅读提示：Methods：RNA-Seq analysis |
| 遗传小鼠模型 | 细胞移植比例（1:1）、受体小鼠辐照剂量（致死剂量）、治疗剂量（20 mg/kg，口服，每周5次，共6周） 阅读提示：Results：Therapeutic efficacy of HSN748 in a genetic mouse model...；Figure 6 图例 |
| PDX模型 | 细胞移植数量（未明确）、辐照剂量（200 rads）、治疗剂量（20 mg/kg，口服，每周5天，共4周） 阅读提示：Results：HSN748 outperforms Gilteritinib...；Figure 7 图例 |